缺氧诱导因子-1与恶性肿瘤关系的研究进展

张璐，方岳，牛继国，陈彻，李海龙，王功臣，张学良，梁艳，呼永华,，张志明

(1.甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000； 2.甘肃省中医院采购办，兰州 730050； 3.甘肃省肿瘤医院 a.核医学科，b.消化肿瘤内一科，兰州 730050； 4.甘肃中医药大学附属医院肿瘤科，兰州 730000)

氧是哺乳动物代谢及生理功能所必需的物质，在细胞能量产生及许多酶的辅助因子和底物反应中起重要作用[1]。当细胞内的总氧分压小于40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)时，细胞处于低氧状态[2]。低氧广泛存在于细胞及组织中，细胞对组织低氧的反应是生命及疾病发生发展中必不可少的过程，细胞感受和适应组织低氧是通过转录因子——缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)调控。HIF具有HIF-1、HIF-2及HIF-3三种亚型，均由氧调节型α亚基和组成型β亚基构成，α亚基是活性亚基，又分为HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α[3]。目前，对HIF-1α和HIF-2α的研究较广泛，但HIF-3α的作用机制尚不清楚[4]。HIF-2α与HIF-1α的同源性高达48%，HIF-1α几乎在所有组织中均有表达，而HIF-2α只在内皮细胞、胶质细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、心肌细胞、肾成纤维细胞、胰腺和十二指肠的间质细胞以及肝细胞中表达，且其在不同肿瘤细胞中的作用尚无定论[5]。由于恶性肿瘤的快速增殖，恶性肿瘤细胞长期处于低氧状态，HIF-1α进行翻译后特异性修饰相关肿瘤基因的表达，以适应低氧环境，如乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中，HIF-1α的表达量增加，当细胞暴露在低氧环境下，HIF-1α在细胞核内聚集并与相关靶基因结合，结合后的靶基因与恶性肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭以及肿瘤细胞的耐药性有关[4]。现就HIF-1与恶性肿瘤关系的研究进展予以综述。

1 HIF-1的结构与作用机制

1.1HIF-1的分子结构 HIF-1是由位于第14号染色体q21-24区的氧调节型α亚基以及位于第1号染色体q21区的组成型β亚基构成的异源二聚体，α亚基是HIF-1特异性的活性亚基，决定了HIF-1的活性，α及β亚基均属于碱性螺旋-环-螺旋-/PAS(PER-ARNT-SIM)蛋白家族，该蛋白家族具有两个重要结构：与DNA结合的碱性螺旋-环-螺旋区以及与另一个亚基形成二聚体并结合特异性靶基因的PAS区[1,6]。HIF-1α的N端连接具有激活转录作用的反式激活结构域，C端分别可连接具有调节转录作用的反式激活结构域和富含脯氨酸/丝氨酸/苏氨酸的氧依赖降解结构域。在常氧情况下，HIF-1α的氧依赖降解结构域的脯氨酸残基发生羟基化，导致α亚基破坏，并通过泛素化使HIF-1α降解[6-7]。N端的反式激活结构域具有核定位信号，在低氧情况下，协助HIF-1α与核孔蛋白结合并入核，与位于细胞核内的β亚基形成稳定的异源二聚体[4,7]，并与CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白p300结合形成CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白p300复合物，该复合物与DNA低氧反应元件的顺式作用元件启动子区(5′-RCGTG-3′)结合，激活多种信号通路相关基因的表达[8-9]。

1.2HIF-1α的氧调节机制 组织及细胞对氧气浓度的适应是由HIF-1α诱导相应靶基因来实现的。研究证实，HIF-1α氧依赖途径主要有两种，脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶(HIF抑制因子)[10]。在常氧环境下，HIF-1α的脯氨酸残基发生羟基化，C端的氧依赖降解结构域与肿瘤抑制蛋白结合，HIF-1α亚基泛素化，并经泛素连接蛋白酶复合体途径降解，HIF-1α的天冬氨酸残基发生羟基化，抑制HIF-1α与CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白p300结合，阻止HIF-1α的转录激活功能[8]。当机体处于低氧状态时，参与O2、Fe2+和2-氧戊二酸等羟基化的底物和辅助激活剂受到限制，导致HIF-1的羟基化发生衰减。HIF-1α在细胞质中积累，随后被转移到细胞核，在细胞核中与HIF-1β亚基形成异二聚体，HIF-1α/β异二聚体与位于O2调控基因内的低氧反应元件的顺式作用元件结合，介导细胞/组织适应慢性或急性低氧，见图1、2[10-11]。

Oxygen Labile：氧不稳定状态；HIF：缺氧诱导因子；bHLH：碱性螺旋-环-螺旋；PAS：PER-ARNT-SIM家族成员；ODD：氧依赖降解结构域；N-TAD：N端反式激活结构域；C-TAD：C端反式激活结构域；EPAS1：内皮PAS区域蛋白1；LZIP：亮氨酸拉链；Constitutively Expressed：持续性表达；ARNT：芳香烃受体核转位因子；TAD：反式激活结构域

Oxygen Concentration：氧浓度；Normoxia：常氧；Proteasome：蛋白酶体；Hypoxia：缺氧；PHD：脯氨酸羟化酶；FIH1：缺氧诱导因子 1抑制因子；α-KG：α-酮戊二酸；VHL：希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白；Pro：脯氨酸；HIF：缺氧诱导因子；Asn：天冬酰胺；HRE：低氧反应元件

2 HIF-1与恶性肿瘤的相互关系

2.1HIF-1促肿瘤的发生、发展 肿瘤的发生是一个复杂的过程，与肿瘤细胞的代谢、细胞因子和细胞之间的相互作用以及肿瘤微环境密切相关。肿瘤细胞的快速增殖和血液供应的缺乏导致肿瘤内部低氧，肿瘤细胞为了适应低氧的微环境，需要激活最重要的调节途径——HIF[12]。在实体肿瘤中，肿瘤细胞表达HIF-1转录因子，诱导肿瘤发生过程中相关因子的表达，包括细胞外基质重构、血管生成、细胞迁移、细胞转移、上皮-间充质转化、耐药性和肿瘤干细胞的维持[13]。多项研究表明，肿瘤细胞内低氧能够促进血管生成、糖酵解、细胞侵袭、细胞存活和免疫逃避，最终导致肿瘤的发生和转移[14-16]。

2.1.1HIF-1与肿瘤的促血管生成 在低氧状态下，肿瘤细胞、内皮细胞和调节性T细胞等介导肿瘤血管生成因子释放[17]。HIF-1是诱导肿瘤血管生成的重要调节因子，参与血管通透性、内皮细胞增殖、基膜降解、出芽、细胞迁移和管状结构生成，从而形成新生血管[18]。相关研究显示，HIF-1调节多种血管生长因子表达的编码基因，包括血管生成素1和2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质衍生因子-1、血小板源性生长因子B和胎盘生长因子[19]。Wang等[20]的实验研究证实，低氧诱导的HIF-1α在4T1小鼠乳腺癌的细胞坏死区可通过上调促血管生成因子促进新生血管的异常生成。

肿瘤血管形成是一个多基因、多信号通路调控的复杂过程，血管生成导致血管密度增大和氧弥散距离减小[21]，肿瘤低氧微环境中HIF-1调节血管生成受肿瘤组织耗氧量增加和氧弥散距离减少的影响[22]。值得注意的是，在暴露于低氧应激的内皮中，HIF-1控制对低氧的初始或急性适应至关重要，并能够促进原始血管网络的形成，而HIF-2和HIF-3则在长时间的氧耗尽后开始表达，促进并维持脉管系统的成熟和稳定[23]。

2.1.2HIF-1与肿瘤的转移、侵袭 肿瘤细胞的恶性程度表现为肿瘤细胞的无限增殖能力和转移特性。肿瘤细胞快速增殖，其需氧量亦增加，但由于氧气弥散的减少，肿瘤细胞处于低氧微环境[21]，低氧是肿瘤微环境的显著特征之一，能够促进并提高肿瘤的侵袭性[24]。在低氧微环境中，肿瘤干/祖细胞及其子代通过诱导低氧区血管形成化较差的肿瘤细胞产生更具侵略性和生存优势的基因表型，肿瘤干细胞/祖细胞及其后代在疾病进展和转移过程中常发生低氧，同时HIF-1α和HIF-2α的表达上调和活性增强。在肿瘤细胞中，HIF的上调可以发生在原发性肿瘤、继发性肿瘤、转移性前列腺癌、乳腺癌的低氧区、白血病细胞以及低氧状态下的骨内膜[25]。当氧分压降低时，HIF-1激活并上调相关细胞因子及信号通路，刺激并增强肿瘤转移。HIF-1通过DNA芯片技术研究证明，超过2%的人类基因受到HIF-1的直接或间接调控[21]。相关研究显示，肿瘤组织中HIF-1α的高表达增加了肿瘤细胞的侵袭能力，并诱导了钙黏蛋白的丢失[26]，肿瘤侵袭及转移范围主要由HIF-1调控的基质金属蛋白酶及赖氨酸氧化酶决定，基质金属蛋白酶及赖氨酸氧化酶能够减少或重塑细胞外基质[27]，同时肿瘤转移和侵袭能力高度依赖于肿瘤-基质的相互作用，如细胞外基质重塑和上皮-间充质转化[28]，HIF-1的靶基因包括提高血管通透性的因子，如VEGF通过提高血管通透性使肿瘤局部微环境发生变化，有利于肿瘤细胞的渗出及转移。已有研究表明，可通过调节结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、胃癌组织中的HIF-1α水平，降低癌细胞的迁移和侵袭能力[29-31]。

2.1.3HIF-1在肿瘤中与微RNA(microRNA，miRNA)的相互作用 miRNA是一类大约由22个核苷酸组成的非编码调控的单链小分子RNA，可与靶基因的3′非翻译区结合，通过与靶基因信使RNA(messenger RNA，mRNA)碱基配对，进而引导沉默复合体，降解mRNA并阻止mRNA转录，影响蛋白质的表达水平，从而抑制基因的表达[32]。miRNA是基因转录后水平的重要调控因子，可以调节大约50%的蛋白质编码基因的活性[33]。研究证实，miRNA是HIF-1的重要调节介质，同时HIF-1又可诱导特异性miRNA(即低氧相关miRNA)的表达[34-35]。HIF-1诱导的miRNA可影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等多种生物学行为。在许多实体瘤中，miRNA的启动子携带了HIF-1α的结合位点。在低氧环境下，miR-210显著上调，上调后的miR-210通过抑制甘油-3-磷酸脱氢酶1的活性来增加HIF-1α的稳定性，miR-210和HIF-1α形成正反馈[36]。微阵列数据表明，miRNA在低氧过程中具有上调或下调两种作用形式[32，37]。Joshi等[29]研究显示，在上皮性卵巢癌中，下调后的miR-199a通过上调HIF-1α的表达量激活赖氨酰氧化酶，赖氨酰氧化酶通过调节细胞外基质的稳定性影响肿瘤的微环境，促进肿瘤的转移。在低氧条件下，部分miRNA起原癌/抑癌基因通过HIF-1α诱导的miR-382直接靶向作用于人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因，并通过抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因促进肿瘤血管的生成[37]。因此，HIF能够正向或负向调节肿瘤细胞中miRNA的含量，并通过相关酶的作用间接促进肿瘤的发生发展或直接调控肿瘤相关基因的表达，从而使肿瘤细胞的生物学行为发生变化。

2.2HIF-1在恶性肿瘤治疗中的作用

2.2.1HIF-1的抑制剂 HIF在恶性肿瘤的血管生成、侵袭及转移等发生发展中起重要的调控作用，其相关抑制剂的研究对于肿瘤的治疗具有重要意义。大多数HIF抑制剂的靶向目标为HIF-1α和HIF-2α，HIF抑制剂主要通过以下作用机制抑制其活性：①影响HIF-α mRNA或抑制HIF-α蛋白合成。EZN-2968又称RO 7070179，是一种含有16个与人HIF-1α mRNA 100%互补的核苷酸残基的反义寡核苷酸，也是一种HIF-1α特异性的靶向剂，以剂量依赖性方式下调HIF-1α mRNA，可在5 nmol/L浓度下完全抑制HIF-1α mRNA的产生，EZN-2968的Ⅰ期临床试验表明，EZN-2968降低了HIF-1α亚基和靶基因的mRNA水平[38-39]。伏立诺他是一种组蛋白脱氢酶抑制剂，通过抑制组蛋白脱氢酶9降低HIF-1α亚基的蛋白质水平，阻断肿瘤血管生成，目前已被美国食品药品管理局批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤[40]。②抑制HIF-α亚基与HIF-β亚基形成的异二聚体。吖啶黄能够直接结合HIF-α的PAS结构域，抑制HIF-1α与HIF-β形成异二聚体，使HIF无法发挥作用[41]。③抑制HIF与DNA结合，HIF通过结合DNA上的低氧反应元件的顺式作用元件，在转录水平上激活靶基因。棘霉素是从一种链霉菌中分离的小分子抗生素，可特异性地与HIF-1和VEGF启动子区的HIF-1α的结合位点序列(5′- TACGTG-3′)结合，从而抑制低氧诱导VEGF的表达[42]。蒽环类和阿霉素可通过抑制HIF-1α与DNA的结合降低HIF-1α的活性[10]。④抑制HIF转录复合物形成。硼替佐米和两性霉素通过增强天冬氨酸羟化酶和HIF-1或C端反式激活结构域之间的相互作用来阻止P300的募集，进而从功能上抑制HIF-1α的作用[10]。

2.2.2磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路抑制剂 PI3K/Akt/mTOR信号通路是影响细胞生长发育及调控的重要途径，恶性肿瘤细胞中的PI3K被激活，并在细胞膜上产生磷脂酰肌醇三磷酸酯，磷脂酰肌醇三磷酸酯作为第二信使激活Akt，活化的Akt使mTOR磷酸化，调节肿瘤细胞的增殖、转移及侵袭[43]。在低氧状态下，低氧作为刺激因素激活了PI3K/Akt/mTOR信号通路，导致HIF-1α表达上调，促进恶性肿瘤的发生发展，其中mTOR是调节HIF-1的核心因子，雷帕霉素是mTOR的第一代抑制剂，但并不直接抑制mTOR活性，而是与FK506结合蛋白12和mTORC1中的FK506结合蛋白12雷帕霉素结构域结合形成三元复合物，发挥变构抑制剂的作用[44]。研究发现，雷帕霉素以浓度依赖方式抑制多种肿瘤组织和动物模型中肿瘤细胞的生长，如乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、小细胞肺癌和肝癌。大豆抗毒素是一种新型的PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂，通过阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制HIF-1α翻译，并阻止HIF-1α和热激蛋白(heat shock protein，HSP)90结合，降低HIF-1的稳定性[45]。肉桂醛是中药肉桂的主要活性成分，具有降糖、减肥、抗菌及抗肿瘤等功能[46]。研究发现，肉桂醛通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路降低HIF-1α蛋白的合成，从而抑制由低氧诱导的血管生成和转移[47]。

2.2.3HSP降低HIF-1的稳定性 在温度升高、低氧、缺血再灌注损伤、病毒感染、营养不良、氧化应激等状态下，HSP的合成和表达量增多，其可参与多种客户蛋白折叠并促进蛋白质成熟，保护客户蛋白免受降解，维持蛋白稳定性[48]。HIF-1α是HSP的客户蛋白之一，在肿瘤细胞中，HSP90与HIF-1α的PAS结构域结合，起到稳定HIF-1α的作用[49]。同时，在恶性肿瘤细胞中，高表达的HIF-1α能刺激HSP90α的分泌，并促进肿瘤细胞的侵袭和转移[50]，因此抑制HSP90能够降低HIF-1α的稳定性，促使HIF-1α蛋白降解，HSP90α分泌减少，抑制肿瘤细胞的侵袭与转移。相关研究显示，17-丙烯氨基-去甲氧基-格尔德霉素通过抑制HSP90影响HIF-1α的稳定性，HIF-1α表达量下降，致使侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2和VEGF的表达量降低，从而抑制甲状腺未分化癌细胞的侵袭能力[51]。AT-533是一种新型的HSP90抑制剂，可通过阻断HIF-1α/VEGF/VEGF受体2信号通路抑制乳腺癌的生长[52]。由此可见，HSP90作为分子伴侣对客户蛋白HIF-1α起到稳定作用，使用HSP90相关抑制剂能够抑制表达HIF-1α的恶性肿瘤的细胞增殖、转移及侵袭。

2.2.4HIF-1增强化疗药物的耐药性 肿瘤化疗药物的耐药性是影响临床肿瘤疗效的主要因素，也是大多数晚期肿瘤患者和不可手术患者治疗失败的主要原因。氧气对抗癌药物活性具有一定的影响，化疗药物在低氧环境下对肿瘤细胞的作用降低。有研究显示，低氧条件下的某些肿瘤细胞的基因表型会发生改变，使肿瘤细胞适应低氧微环境并对化疗药物产生耐药性，如依托泊苷、阿霉素。关于HIF-1介导的耐药机制还包括上调葡萄糖以及氧调节蛋白的表达，DNA过度复制，细胞周期阻滞，细胞代谢改变和遗传不稳定性[53]。此外，耐药低氧诱导基因在抗肿瘤药物的耐药中也起到关键作用。HIF-1介导并调节药物外排，并能够在低氧环境下激活多重耐药基因1，多重耐药基因1编码膜内P-糖蛋白，P-糖蛋白属于ATP结合盒转运蛋白家族，可作为药物外排泵，在一定范围内降低细胞内化疗药物的浓度[54]。低氧也是细胞自噬的驱动因素，低氧诱导的自噬与耐药之间存在一定的联系。自噬是肿瘤细胞对化疗诱导细胞凋亡的保护性反应，能够促使受损细胞的降解[55]。例如，在对顺铂的反应中，低氧增强顺铂诱导的HIF-1自噬作用，抑制肺癌细胞对顺铂的敏感性[56]。低氧状态下，通过激活HIF-1α/B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3/自噬相关基因1信号通路增强细胞自噬能力，从而介导膀胱癌对吉西他滨化疗产生耐药[57]。除内在调控因素外，HIF-1介导肿瘤细胞的耐药机制还存在一定的外在因素。相关证据表明，程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1(ligand of programmed death 1，PD-L1)也可导致肿瘤细胞对常规化疗药物产生耐药性。PD-L1是程序性细胞死亡受体1的主要配体，在髓系、淋巴细胞、正常上皮细胞和癌症组织中均有表达。PD-L1在肿瘤中的高表达与肿瘤细胞免疫逃避密切相关，并且有助于抑制细胞凋亡[58-59]。Noman等[60]的实验证实，在低氧条件下，HIF-1可直接结合PD-L1近端启动子上具有转录活性的HIF-1α的结合位点，上调PD-L1表达。

2.2.5HIF-1降低放疗的敏感性 目前，放疗已成为恶性肿瘤治疗的重要手段之一，约70%的肿瘤患者治疗过程需要放疗的干预，40%的肿瘤患者通过放疗达到治愈[61]。放疗在临床中的应用广泛，但在治疗过程中可能产生放疗敏感性抵抗等，影响临床疗效。研究显示，低氧可以通过抑制Akt/mTOR/p70核糖体S6蛋白激酶途径增强电离辐射诱导的自噬，从而增强放射抵抗性[62]。Luo等[63]研究发现，沉默神经胶质瘤中的HIF-1α能够增强患者对放疗的敏感性，提高疗效。

3 小 结

HIF-1作为低氧条件下的重要转录因子，在恶性肿瘤细胞中高表达，并与肿瘤的生物学行为密切相关。HIF-1参与促进肿瘤血管的生成，并可增强肿瘤细胞的侵袭及转移能力，鉴于HIF-1与肿瘤的广泛联系，HIF-1能够作为恶性肿瘤治疗过程中的药物靶点，通过药物的抑制作用降低或阻止肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等特性，提高恶性肿瘤的治疗效果。在低氧状态下，肿瘤细胞通过改变基因表型、影响葡萄糖代谢、细胞凋亡和自噬等途径，刺激肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，增加了治疗的难度，对于放疗患者，HIF-1可以通过抑制Akt/mTOR/p70核糖体S6蛋白激酶信号通路降低放疗的敏感性。因此利用有效药物降低低氧状态下肿瘤细胞HIF-1的表达，有助于降低患者对放化疗的抵抗性，起到协同增敏的作用。HIF-1α的高表达可能成为预示胃癌不良预后的指标之一[64]，随着对HIF-1的结构、功能、调控机制以及在肿瘤中作用的深入研究，将为恶性肿瘤的预防与治疗开辟新的方向。