外泌体来源的微RNA在心血管疾病中的作用及中药干预的研究进展

杨林静，宗文静

(首都医科大学中医药学院，北京 100069)

《中国心血管病报告2018》显示，我国心血管病的患病率和病死率仍处于上升阶段，目前我国心血管病患病人数约为2.9亿，病死率超过40%[1]。心血管疾病严重危害人类的身心健康，防治心血管疾病已成为目前医学研究的重点。外泌体介导了心脏细胞间的信息传递，随着其内容物微RNA(microRNA，miRNA)的发现，外泌体来源的miRNA在心血管系统中的作用机制逐渐成为研究热点。研究表明，外泌体来源的miRNA与心血管疾病的发生、发展密切相关[2]。外泌体内的特定miRNA参与心血管的病理、生理及修复再生等环节，具有促进血管生成、细胞增殖以及抑制纤维化、抗炎等作用[3]。目前虽然已进行了大量研究，但外泌体来源的miRNA在心血管疾病中的调控机制仍不明确。传统中药对心血管疾病有较好的疗效，但存在有效成分溶解率低、生物利用度不高、疗程较长等不足，而利用外泌体可以更好地递送中药的有效成分[4]。部分研究者也正聚焦于中药对心血管疾病中外泌体来源的miRNA作用机制的研究[5]，期待可以更好地发挥中药的疗效。现就外泌体来源的miRNA在心血管疾病中的作用及中药干预机制的研究进展予以综述。

1 外泌体的基本特征

1.1外泌体的构成 外泌体是由细胞分泌至细胞外的直径为30～100 nm的双层囊泡状小体[6]，携带多种信息成分，包括蛋白质、脂类、miRNA、长链非编码RNA和信使RNA等。研究显示，外泌体表面已被识别的蛋白包括热激蛋白、转膜蛋白和融合蛋白、多囊泡体生成相关蛋白、四次跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81和CD82)、脂质相关蛋白以及外泌体来源的细胞特异性蛋白等[7]。虽然外泌体的外膜也是脂质双分子层结构，但双层脂质膜可为外泌体内容物提供保护，防止miRNA被分解，保证了miRNA在体液中有较好的稳定性[8]。

1.2外泌体的形成和分泌 不同来源的细胞均可形成外泌体，其形成机制大致相同。首先，细胞内的内涵体通过向细胞腔内发芽而形成多囊泡体，此过程需要在内吞转运复合体及相关蛋白(如肿瘤易感基因101、CD63)的调控下进行；随后，在Rab家族鸟苷三磷酸酶的作用下，多囊泡体与细胞膜融合，并将腔内的多个囊泡释放到细胞外基质中，形成外泌体[9]。多种不同类型的细胞均可分泌外泌体，如血细胞、干细胞、内皮细胞、淋巴细胞、血小板以及平滑肌细胞等[10]；外泌体广泛存在于体液中，如尿液、唾液、乳液、血液、胸腔积液、心包积液以及脑脊液等[11]。

2 外泌体来源的miRNA及其生物学特征

2007年，Valadi等[12]首次于肥大细胞分泌的外泌体中发现了miRNA，自此有关外泌体来源的miRNA的研究越来越多。研究证实，外泌体来源的miRNA参与心血管发育、再生和修复过程，对心脏功能具有促进或抑制作用[13]。

miRNA是一段长为19～25个核苷酸的内源性单链RNA分子，细胞核内的miRNA相关基因序列经过转录、切割，生成前体miRNA，再由蛋白转运至细胞质，在细胞质内质网进一步剪切修饰为成熟的双链RNA，其中一条单链作为客链被降解，另一条单链与RNA诱导的沉默复合体结合形成成熟的miRNA[14-16]；随后，miRNA与信使RNA 3′端的碱基序列互补结合，导致RNA降解或抑制信使RNA靶蛋白的翻译，调节基因表达[17]。目前研究证实，外泌体来源的miRNA有两大功能：①常规功能，即基因调控功能，一个miRNA往往能够调控上百个信使RNA和蛋白质的表达；②配体功能，外泌体来源的miRNA可以作为配体与Toll样受体结合[18]。miRNA被包裹在外泌体内，通过自分泌、旁分泌的方式作用于靶细胞，影响细胞功能，以此介导细胞间的信号传递[19]。这一过程依赖于外泌体双层脂质膜良好的稳定性，防止miRNA在循环中被核酸酶降解，同时，外泌体膜还可抵御不同的低温环境，为其内容物提供良好的储存条件[20]。

3 外泌体来源的miRNA在心血管疾病中的作用

3.1动脉粥样硬化 动脉粥样硬化的发病机制较为复杂，与内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、血栓形成以及炎症细胞浸润等密切相关。Hergenreider等[21]将表达Krüppel样因子2的血管内皮细胞来源的外泌体注入高脂饮食饲养的ApoE-/-小鼠体内，结果发现，与对照组相比，实验组小鼠动脉粥样硬化面积显著缩小；进一步研究证实，外泌体内富含的miR-143和miR-145被平滑肌细胞摄取，抑制了平滑肌细胞增殖，发挥了抗动脉粥样硬化作用。有研究显示，外泌体来源的miR-126可以为内皮细胞提供保护，miR-126通过调节G蛋白信号转导调控因子16，缩小斑块面积，减少巨噬细胞渗透[22]。还有研究显示，血小板来源的外泌体富含的miR-320可以下调细胞间黏附分子1的表达，减少炎症和血栓形成，起到抗动脉粥样硬化的作用[23]。Yao等[24]研究表明，血小板来源的外泌体富含的miR-25-3p可抑制ApoE-/-小鼠冠状血管内皮的炎症反应，其机制是外泌体富含的miR-25-3p通过抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路延缓炎症进程，进而抑制动脉粥样硬化的发展。另有研究表明，经氧化型低密度脂蛋白处理的人脐静脉内皮细胞可激活NF-κB信号通路，诱导人脐静脉内皮细胞来源的外泌体内miR-505表达增加和网状结构形成，加重动脉粥样硬化的进程[25]。由此可见，外泌体来源的miRNA不仅可抑制动脉粥样硬化的发展，还可促进动脉粥样硬化斑块的形成。血管平滑肌细胞分泌的外泌体miR-155从平滑肌细胞转移到内皮细胞，进而破坏内皮屏障的完整性，导致内皮通透性增加和动脉粥样硬化进展增强，该过程可能与Krüppel样因子5有关，而阻断外泌体介导的miR-155在平滑肌细胞与内皮细胞间的转移，可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点[26]。

此外，炎症反应在动脉粥样硬化发生、发展过程中也扮演重要角色。巨噬细胞在调节炎症应答方面起重要作用，巨噬细胞来源的外泌体分泌的miR-124升高，抑制了巨噬细胞活化，使炎症细胞渗透减少，发挥抗炎作用[27]。外泌体来源的miRNA在动脉粥样硬化发展的各个环节均具有关键作用，如何提高miR-126、miR-25-3p、miR-124等外泌体来源的miRNA的表达水平可能是未来研究的方向。

3.2心力衰竭 在心力衰竭发生后，外泌体中的miRNA水平会发生改变，如miR-1、miR-21、miR-133a/b以及miR-214水平在心力衰竭过程中会增高，发挥保护心肌细胞的作用[28]。研究表明，心肌梗死后出现新发心力衰竭患者的血浆外泌体miR-192、miR-194和miR-34a的表达水平均增高[29]。Qiao等[30]通过体外实验证实，心力衰竭患者基质细胞来源的外泌体富含的miR-21-5p表达失调，恢复miR-21-5p表达可改善心肌受损；进一步研究表明，miR-21-5p通过抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因，增强蛋白激酶B的活性，从而促进血管生成和心肌细胞存活。而间充质干细胞来源的外泌体miR-221表达增加可降低p53上调凋亡调控因子的表达，减少心肌细胞凋亡，增强心脏的保护作用[31]。

3.3心肌梗死 心肌梗死是心脏疾病中的急危重症，早期快速诊断对疾病的治疗及预后均具有重要意义。Kuwabara等[32]研究发现，在心肌梗死区及梗死周边区，心肌细胞受损后其外泌体含有的miR-1和miR-133a释放入血，导致血浆中的miR-1和miR-133a水平均升高，提示外泌体来源的miRNA可作为诊断心血管疾病的潜在标志物，为早期诊断心肌梗死提供帮助。Luo等[33]研究表明，在缺氧诱导过程中，脂肪干细胞来源的外泌体富含的miR-126过表达可以下调炎症因子的表达，减轻H9C2心肌细胞损伤，促进微血管生成和迁移，同时还可以通过减少纤维化相关蛋白质的表达降低心肌纤维化程度，这可能是心肌梗死后外泌体miR-126改善心脏功能的机制。此外，外泌体来源的miR-1、miR-126还可通过抑制Spred蛋白的表达，促进新生血管的形成[34]；骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-132过表达，可调节Ras/促分裂原活化的蛋白激酶通路，促进心肌梗死区新生血管的形成[35]。人子宫内膜来源的间充质干细胞外泌体miR-21可促进心肌梗死后血管生成，且miR-21对心脏的保护作用优于骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞，提示人子宫内膜来源的间充质干细胞可能成为治疗心血管疾病的首选细胞[36]。

心脏祖细胞来源的外泌体通过miR-146a抑制心肌细胞的凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤，缩小心肌梗死面积[37]。有研究显示，向急性心肌梗死小鼠注射胚胎干细胞来源的含有miR-22的外泌体，可以下调甲基化CpG结合蛋白2，从而刺激血管生成，减小梗死面积，改善心脏功能[38]。另外，骨髓间充质干细胞外泌体分泌的miR-301可能通过抑制心肌细胞自噬，减少心肌梗死面积[39]。

3.4心肌病 外泌体来源的miRNA在心肌病的发展过程中也有重要作用。Wang等[40]通过研究糖尿病心肌病小鼠发现，心肌细胞来源的外泌体miR-320水平增高，而胰岛素样生长因子1、热激蛋白20和内皮素2水平均降低，导致心脏内皮血管生成功能受损，敲除miR-320则可以消除心脏内皮血管生成受损，这也证实了miR-320水平增高可抑制小鼠心脏内皮细胞迁移和新生血管形成。另有研究显示，围生期心肌病患者内皮细胞来源的外泌体miR-146a在催乳素的诱导下表达增高，从而抑制血管生成[41]。此外，外泌体来源的miRNA也可抑制心肌病的发展进程，保护心脏功能。间充质干细胞源性的外泌体分泌的miR-22、miR-146和miR-210均能阻断糖尿病性心肌病小鼠的转化生长因子-β信号通路，减轻心肌纤维化，改善心功能[42]。骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-223在脓毒性心肌病中具有保护作用，可能是由于miR-223可下调信号转导及转录激活因子3的表达，并可减轻炎症反应的发生[43]。

3.5心肌纤维化 高血压使心脏长期超负荷、压力增大，以致发生病理性心肌重构，同时伴随心肌肥厚和心肌纤维化形成。研究表明，机械牵张刺激后，心肌细胞中的miR-378以外泌体途径进入心肌成纤维细胞，导致miR-378水平增加，并通过调节p38促分裂原活化的蛋白激酶和信号转导及转录激活因子3信号通路抑制成纤维细胞中与纤维化相关的信使RNA和蛋白的表达，进而抑制心肌纤维化的形成[44]。还有研究表明，心力衰竭患者血浆细胞以及经血管紧张素Ⅱ处理的心肌成纤维细胞外泌体中miR-425和miR-744的水平均降低，而miR-425和miR-744可通过抑制转化生长因子-β1的表达，降低受体蛋白的表达，从而抑制心肌纤维化，提示血浆外泌体中的miR-425和miR-744可能成为预测心肌纤维化和心力衰竭的标志物[45]。对于急性心肌梗死导致的心肌纤维化，已有研究表明，间充质干细胞来源的外泌体miR-22可以通过结合甲基化CpG结合蛋白2，抑制心肌细胞纤维化，减轻急性心肌梗死后心肌坏死纤维化程度[46]。此外，骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-29和miR-24的表达增高以及miR-2、miR-15、miR-34和miR-130等表达降低，均能够抑制心肌纤维化及炎症进程，改善心肌梗死后小鼠的心功能[47]。

4 中药对心血管疾病中外泌体来源的miRNA的靶向干预作用

4.1复方中药 补阳还五汤是治疗因虚致瘀脑卒中后遗症的常用中药复方，在临床上广泛应用于气虚血瘀型的心血管疾病，如冠心病、高血压等，均有较好的疗效[48]。研究表明，补阳还五汤的有效成分可增加骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-126表达，降低miR-221和miR-222的表达，同时还可激活血管内皮生长因子，促进血管生成，减轻缺血性疾病的损伤[49]。miR-126可促进腺苷酸活化蛋白激酶的表达，而且可激活成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子，促进血管生成，说明补阳还五汤中的有效成分能通过外泌体调控相应miRNA的表达，促进血管生成，改善缺血[50]。

通心络是由人参、酸枣仁、赤芍、檀香、降香、水蛭、蝉蜕、蜈蚣、全蝎、土鳖虫、乳香以及冰片12味中药组成的复方提取物，临床可用于冠心病心绞痛、急性心肌梗死以及缺血性脑卒中的治疗。现有研究表明，通心络可以减少高脂饮食饲养的ApoE-/-小鼠的斑块面积，具有抗动脉粥样硬化作用；通心络还可通过抑制外泌体miR-155的分泌、阻断miR-155的表达，达到抗动脉粥样硬化的目的[51]。

4.2中药单体

4.2.1丹皮酚 丹皮酚是中药牡丹皮的提取物，具有抗动脉粥样硬化的作用，是治疗心血管疾病的常用药。Liu等[52]研究表明，口服丹皮酚的高脂ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块较对照组(未口服丹皮酚的高脂ApoE-/-小鼠)显著减少，体内实验证实，丹皮酚可抑制动脉粥样硬化的发展，增加内皮细胞来源的外泌体miR-223表达，降低内皮细胞中信号转导及转录激活因子3和磷酸化信号转导及转录激活因子3的表达；同时进一步阐明，丹皮酚在体内外对血管炎症反应的保护机制与miR-223相关，增加miR-223的表达可降低内皮细胞的炎症反应。研究显示，丹皮酚可通过增加高脂血症大鼠血浆外泌体miR-223的表达，抑制下游核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体信号通路，减轻大鼠主动脉内皮细胞的炎症，起到抗动脉粥样硬化的作用[53]。

4.2.2姜黄素 姜黄素是从姜科姜黄属植物中提取的多酚类物质，药理作用广泛，毒性低，耐受性好。现有研究已经证实，姜黄素具有抗炎、抗血脂、抗氧化以及抑制血小板聚集等特性[54]。高同型半胱氨酸血症可导致动脉粥样硬化的发生，经姜黄素处理的细胞外泌体可以减轻高同型半胱氨酸血症导致的内皮细胞损害，但其具体作用机制目前尚未明确[55]。另有研究显示，经姜黄素处理后，慢性粒细胞白血病细胞释放的外泌体组成发生了改变，其外泌体富含的miR-21进入内皮细胞，从而下调人脐静脉内皮细胞中Ras同源物基因家族成员B的表达，维持内皮屏障稳定，同时姜黄素还减弱了外泌体的促血管生成作用[56]。维持血管内皮稳定可以减少动脉粥样硬化斑块破裂的风险，可能为动脉粥样硬化的治疗提供新思路。

4.2.3淫羊藿苷 淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等药理作用[57]。随着研究的不断深入，淫羊藿苷对心血管疾病的防治作用已得到证实[58]。现有研究证明，淫羊藿苷可以显著提高缺氧条件下间充质干细胞的增殖活性，抑制细胞凋亡，同时还可提高多种促血管生成相关miRNA在细胞和外泌体的表达；低浓度淫羊藿苷对外泌体miR-126的表达有显著的促进作用，miR-126经过旁分泌的方式作用于心内膜，并通过SPRED1(sprouty-related protein with an EVH1 domain 1)和磷酸肌醇-3-激酶调控亚基2介导的血管内皮生长因子信号通路，促进内皮细胞内环境稳定和血管生成，在缺血性疾病中发挥积极作用[59]。

5 小 结

外泌体参与细胞间信号转导和物质传递，其分泌的miRNA在心血管疾病的发生、发展中起重要作用。外泌体来源的miRNA具有促进血管生成、调控细胞凋亡、抗炎、抑制纤维化等作用，在心血管疾病的治疗方面有良好的应用前景。中药及其有效成分可以通过调节外泌体来源的miRNA的表达，发挥对心血管疾病的调控作用，这可能为临床治疗及新药研发提供新的思路。但该领域的研究尚处于起步阶段，仍需进一步深入探究中药对外泌体来源的miRNA的靶向干预机制。此外，对于同种疾病的不同证型，中药对外泌体miRNA的影响是否会发生改变等也仍有待深入探讨。相信未来外泌体来源的miRNA可能会成为中医药防治动脉粥样硬化的新靶点。