交联透明质酸钠凝胶重金属总量检测方法比较与探讨

刘叶，彭健，赵长帅，孙兴霞，亓晓庆

(山东省医疗器械产品质量检验中心，山东 济南 250101)

交联透明质酸钠凝胶是基于透明质酸钠凝胶优异的黏弹性、保湿性、生物相容性、可降解性等性能特性，通过添加一种或多种组合的化学交联剂而获得[1-4]。交联透明质酸钠凝胶更好的机械支撑性能和抗降解性能，同时也保留透明质酸钠凝胶良好的生物相容性，非免疫原性等优势，被广泛应用于组织工程、医疗美容领域(除皱、塑性以及面部年轻化等治疗)[5-6]。据统计，全球透明质酸填充剂市场将以年复合增长率12%的速度，从2016 年的17亿美元增长到2020年的27亿美元[7]。

作为植入人体并在人体内存在较长时间的特殊医疗器械产品，交联透明质酸钠凝胶在其原料生产过程和交联过程中都有可能引入各种对人体有害的微量重金属[8-9]，因此交联透明质酸钠凝胶中重金属限量检测是一项有重要安全意义的基础检测。目前我国医药行业对产品中重金属限量的相关检测主要依据《中国药典》[10]进行，《中国药典》2015年版0821重金属检测法共3个检测方法，第一法(硫代乙酰胺法)适用于供试品可不经过有机破坏，在酸性溶液中显色的重金属限量检查；第二法(炽灼残渣法)是将供试品炽灼破坏后，加硝酸、硫酸加热处理，使有机物分解、破坏完全后，再按硫代乙酰胺法进行检查，适用于在水、乙醇中难溶解的供试品的重金属限量检查；第三法(硫化钠法)适用于供试品能溶于碱而不溶于酸(或在稀酸中生成沉淀)的重金属限量检查。本试验综合考虑市售和在检作为医疗器械产品使用的交联透明质酸钠凝胶情况，选取两类具有代表性的非含药交联透明质酸钠凝胶产品和含药交联透明质酸钠凝胶产品按照第三法(硫化钠法)和第二法(炽灼残渣法)进行重金属限量检测，追踪实验过程并进行实验结果分析。

1 试验部分

1.1 标准溶液和试剂配制

1.1.1 标准铅溶液的制备 铅标准贮备液：称取硝酸铅0.159 9 g ,置1 000 mL量瓶中，加硝酸5 mL与水50 mL溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL相当于100 μg 的Pb2+)。

铅标准溶液：精密量取贮备液10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL相当于10 μg 的Pb2+)。本液仅供当日使用。配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅。

1.1.2 试剂配制 氢氧化钠试液、硫化钠试液、乙酸盐缓冲液(pH 3.5)、 硫代乙酰胺试液、酚酞指示剂、氨试液均按照《中国药典》2015年版配制。硝酸、硫酸、盐酸均为分析纯试剂。

1.2 样品 样品A 注射用交联透明质酸钠凝胶 重金属总量(以Pb2+计)：应不大于5 μg·g-1。

样品B 含利多卡因注射用交联透明质酸钠凝胶 重金属总量(以Pb2+计)：应不大于5 μg·g-1。

1.3 试验器具及设备 电子天平、25 mL纳氏比色管、移液管、坩埚、电热炉、马弗炉、水浴锅。

1.4 试验方法

1.4.1 精确称取样品A 2.00 g置于1号管，样品B 2.00 g置于2号管，精确移取铅标准溶液1 mL置于3号管中，3个纳氏比色管中分别加氢氧化钠试液5 mL，再分别加水至25 mL，摇匀，3管中分别加硫化钠试液5滴，摇匀，置白纸上，自上向下透视，比较颜色深浅。

1.4.2 等待“1.4.1”项下反应完成后，过滤1号管与2号管中的试验液，截留凝胶颗粒，将凝胶颗粒分别转移至4号管和5号管，2个纳氏比色管中分别加入铅标准溶液1 mL，同时移取铅标准溶液1 mL置于6号管作为对照管，3个纳氏比色管中分别加氢氧化钠试液5 mL，再分别加水至25 mL，摇匀，3个纳氏比色管中分别加硫化钠试液5滴，摇匀，置白纸上，自上向下透视，比较颜色深浅。

1.4.3 精确称取样品A 2.00 g置于1号坩埚，样品B 2.00 g置于2号坩埚，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸0.5 mL，使恰湿润，用低温加热至硫酸除尽后，加硝酸0.5 mL，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在550 ℃炽灼使完全灰化，放冷，加盐酸2 mL，置水浴上蒸干后加水15 mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色，再加醋酸盐缓冲液(pH 3.5)2 mL,微热溶解后，移置纳氏比色管中，加水稀释成25 mL分别作为7号管和8号管；将加入相同量硝酸和盐酸的另一瓷坩埚置于水浴上使之蒸干后，另取一纳氏比色管加醋酸盐缓冲液(pH 3.5)2 mL与水15 mL,加标准铅溶液1 mL(每1 mL相当于10 μg 的Pb2+)，再用水稀释成25 mL，作为9号管；再在三管中分别加硫代乙酰胺试液各2 mL，摇匀，放置2 min，同置白纸上，自上向下透视，进行比色。

2 试验结果

表1 试验结果汇总表

3 结果分析

通过以上试验现象和产品本身特性有几个部分值的讨论：

图1 交联透明质酸钠凝胶颗粒溶解情况(左1号管、右2号管)

3.1 目前对交联透明质酸钠凝胶重金属限量的检测，大多依据《YY/T 0962-2014 整形手术用交联透明质酸钠凝胶》要求[11]，而《YY/T 0962-2014整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中对于重金属限量检测规定按照《中国药典》2015年版0821重金属检测法中第三法进行，如试验“1.4.1”项下所示，交联透明质酸钠为非水溶产品，加入氢氧化钠试液、水、硫化钠试液后，仍不会溶解，悬浮于水中，肉眼可见小颗粒，又由于其密度大于水，随着时间的推移交联透明质酸钠颗粒会沉积在纳氏比色管底部，形成明显分层，晃动纳氏比色管又会形成悬浮于水中的肉眼可见小颗粒，因此无法达到完全的均一溶液进行目视比色。

3.2 交联透明质酸钠凝胶是由透明质酸原料加入一种或多种组合的化学交联剂等经过一系列反应形成的最终产物，按照“1.4.1”项下试验方法进行试验时，样品未解交联进行检测时，原理上硫化钠试液只能和未交联的透明质酸钠以及缓冲盐体系中的重金属进行反应，而凝胶颗粒内部所含的重金属无法与显色剂反应，实际上“1.4.1”项下试验未能体现样品的重金属总含量的检测目的。

3.3 如试验“1.4.2”项下方法所进行，通过过滤已经完全反应的未交联的透明质酸钠凝胶以及缓冲盐体系中的重金属，截留交联透明质酸钠凝胶颗粒，通过加入一定量的重金属标准溶液考察交联透明质酸钠凝胶颗粒对重金属显色反应的影响，加标试验显示由于交联透明质酸钠颗粒的存在会产生散射作用，使铅标准溶液与硫化钠的显色反应所呈现的颜色比正常状态下两者的显色反应所呈现的颜色浅，试验说明由于交联透明质酸钠凝胶颗粒的存在致使反应体系不能正确体现产品中的重金属总含量的真实情况。

3.4 试验“1.4.3”项下通过消化处理交联透明质酸钠凝胶，能全面考察产品中重金属总量，既包括产品中游离透明质酸钠凝胶、缓冲盐体系以及交联透明质酸钠凝胶颗粒内的总金属，又能避免交联透明质酸钠凝胶颗粒对显色反应的影响，在对含有盐酸利多卡因的交联透明质酸钠进行检验时，通过消化处理后，药物也不会对该试验造成影响，说明炽灼残渣法试验适用性强，并且整个试验安全可控，建议企业可参考该方法进行技术要求规定，以便更好地进行产品检测。