川芎质量标准的研究

胡 杨，丁晓倩，严 辉*，吴垠志，彭国平，黄胜良

(1.南京中医药大学，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室，江苏 南京 210023；2.江苏融昱药业有限公司，江苏 淮安 223001）

中药材的质量是整个中医药产业链的基石,中共中央、国务院发布《关于促进中医药传承创新发展的意见》,提出“大力推动中药质量提升和产业高质量发展”,要求“加强中药材质量控制,促进中药饮片和中成药质量提升,促进中药饮片优质优价”［1］。然而目前市场用于规范中药材质量的法定标准《中国药典》 实行的是最低准入标准,除少数品种外大多未规定其农药残留、重金属等指标［2］,也未对药材商品规格等级做进一步区分。

川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.(L.chuanxiong) 的干燥根茎,始载于《神农本草经》,列为上品,具有活血行气、祛风止痛之功效,是临床常用的大宗中药材［3-4］。传统川芎的商品等级划分主要依据其个头大小,但划分的科学内涵尚不明确,现行川芎质量标准含量测定项下仅对阿魏酸进行限定,检测指标单薄,无法全面的评价药材饮片的质量优劣［5］。同时,被誉为“产后第一方” 的新生化颗粒,由当归、川芎、益母草、桃仁和红花等7 味药组成,在妇科用药领域需求量大。现行质量控制标准为国家药品标准(WB3-B-1056-91-2015),该标准只收载了理化鉴别项生物碱的沉淀反应及当归、川芎中仅以阿魏酸为对照的薄层鉴别,不利于生产和使用的相关部门控制其药品质量［6］。而对源头药材的质量标准提升可以更好的全面控制［7］。本研究在2020 年版《中国药典》 川芎项下检测项目基础上,建立了川芎药材多指标成分检测方法,增加川芎重金属和有害元素残留量,农药残留量检测限,同时使用一测多评法对川芎5 种指标成分进行测定,以期寻找川芎药材等级与各质控项之间的内在关联,客观有效表征川芎优质药材标准,为提升新生化颗粒等含川芎组方产品的质量提供科学依据。

1 材料

BP211D 型电子天平［赛多利斯科学仪器(北京) 有限公司］；RT-1236 型马弗炉(北京盈安美诚科学仪器有限公司)；NexION 350D 型电感耦合等离子体质谱仪(美国Perkin Elmer 公司)；TSQ 8000 EVO 气相色谱串联质谱分析仪(美国赛默飞公司)；2695 型高效液相色谱仪、2998PDA 型紫外检测器(美国Waters 公司)；Anke TGL-16B 离心机(上海安亭科学仪器厂)；HG-9023A 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；KH-500DB 型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；XFB-200 型高速中药粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)。

阿魏酸对照品(批号110773-201614,纯度≥99%,中国食品药品检定研究院)；藁本内酯、丁烯基苯酞对照品 (批号分别为 CHB160428、CHB160404,纯度≥98%,南京金益柏生物科技有限公司)；阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A (批号分别为lw80315016、lw18050223,纯度≥98%,南京良纬生物科技有限公司)；洋川芎内酯Ⅰ、绿原酸、洋川芎内酯H (纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)；冰醋酸等试剂为分析纯；超纯水(Milli-Q超纯水系统制备)。

从江苏融昱药业有限公司、四川什邡市隐峰镇农产品专业合作社等共收集28 批川芎药材,经南京中医药大学药学院严辉副教授鉴定为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎。信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 性状鉴别及等级形态学参数测定 依据2020年版《中国药典》 及《中药材商品规格等级 川芎》 (TCACM 1021.51—2018) 团体标准对川芎药材的大小、形状、色泽及质地等性状进行描述,利用数码相机拍摄并记录。采用四分法对每批样品进行取样,随机选取1 kg 川芎药材,测定每份样品个数和质量,重复3 次取平均值,结果发现,川芎一等品每40 个以内/kg,单个质量不低于20 g；二等品70 个以内/kg,单个质量不低于12 g,三等品70 以外/kg,统货不分大小。

2.2 杂质、水分、灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物 按2020 年版《中国药典》 (四部)［8］杂质检查法(通则2301),水分测定法(通则0832)第四法,灰分测定法(通则2302) 项下总灰分及酸不溶性灰分测定法,浸出物测定法(通则2201)项下的醇浸出物测定法(热浸法) 分别对杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物进行测定。

2.2.1 杂质检查 川芎药材的杂质检查情况结果发现一、二、三等品无杂质,统货的杂质质量分数0.2%～3.0%。依据《七十六种药材商品规格标准》 规定杂质含量不超过10.0%的要求,各批药材杂质含量符合要求。

2.2.2 水分测定 检测结果显示,28 批川芎药材样品其水分含量多在6.98%～11.38%范围内浮动,平均值9.11%,均未超出《中国药典》 中对中药药材含水量不超过12.0% 的限度要求,川芎一等品水分含量9.56%～10.64%,平均值10.15%；二等品水分含量7.57%～7.99%,平均值7.80%；三等品水分含量6.98%～8.73%,平均值8.09%；统货水分含量8.66%～11.38%,平均值10.41%,见图1。

图1 川芎药材中水分、灰分和醇溶性浸出物含量的频率分布直方图Fig.1 Frequency distribution histogram for intrinsic indexes of L.chuanxiong

2.2.3 总灰分和酸不溶性灰分检测 28 批川芎药材样品总灰分在4.03%～7.93%范围内,酸不溶性灰分在0.75%～3.09%范围内,不同批饮片灰分测定结果波动大,且总灰分高的酸不溶性灰分也高。部分样品超出《中国药典》 中对中药药材总灰分和酸不溶性灰分的限度要求 (6 批总灰分大于6.0%,4 批酸不溶性灰分大于2.0%),推测可能与药材样品泥沙杂质过多有关,建议市售与产区药材需要进行杂质清理以便深入进行灰分过高原因探究。

2.2.4 醇溶性浸出物测定 经检验,28 批样品中,醇溶性浸出物含量在16.85%～35.01%范围内浮动,平均值28.38%,皆大于药典限定要求的12.0%,结合文献报道什邡地区川芎浸出物平均值30.91%,分析种质资源对川芎质量影响明显,同时产地及栽培技术也可能是影响其醇浸出物含量的重要因素［9］,综合各批结果,参考香港中药材标准中对川芎浸出物检测限的规定［10］,建议可提高川芎药材醇溶性浸出物限度不得小于20.0%,优质药材限度不得小于25.0%。

2.3 重金属和有害元素测定 委托南京卡文思检测技术有限公司,利用NexION 350D 型电感耦合等离子体质谱仪,按《中国药典》 收载的铅、镉、砷、汞、铜测定法(通则2321) 对收集的川芎药材进行重金属及有害元素测定,结果见表2。数据显示,5 种重金属的残留量均未超过《中国药典》所规定的限度,其中铅、砷2 种元素在川芎药材中均未检测出,镉元素含量在0.44～0.67 mg/kg 范围内浮动,平均值0.52 mg/kg,与郭兰萍等［11］统计常用中药材重金属超标情况,川芎中镉含量平均值为(0.54±0.49) mg/kg 一致。

2.4 农药残留量测定 在川芎生产过程中,由于遭受根腐病、白粉病、蛴螬、茎节蛾等多种病虫害,产地药农多施用化学农药进行防治。据调查,目前使用的农药主要有甲基硫菌灵、毒死蜱和拟除虫菊酯类等［12］。本实验委托南京卡文思检测技术有限公司,利用气相色谱串联质谱分析仪,按照药典收载的农药残留量测定法(通则2341) 对收集的川芎药材进行农药残留测定,结果见表2,表明9 种农药残留量均未超过国家标准所规定的最高限度(GB 2763—2016 《食品安全国家标准——食品中农药最大残留限度》),除了统货CX Ⅳ-7 批的二甲戊灵残留量(0.297 mg/kg) 超过最高限度(0.2 mg/kg),同时发现统货批农药残留相比什邡产区仍较高,结合文献报道低剂量使用农药有利于“高产优质” 川芎药材的生产,综合各批结果,建议该9 种农药残留量测定限为含敌敌畏不得过0.01 mg/kg；二苯胺不得过0.2 mg/kg；毒死蜱不得过0.1 mg/kg；二甲戊灵不得过0.01 mg/kg；pp-DDT不得过0.01 mg/kg；联苯菊酯不得过0.02 mg/kg；甲氰菊酯、氯菊酯和溴氰菊酯不得检出。

表2 样品中重金属及农药残留含量测定结果（mg/kg， n=3）Tab.2 Results of content determination of heavy metals and pesticide residue in samples （mg/kg， n=3）

2.5 样品含量测定 川芎中主要含有机酚酸、苯酞、生物碱类成分,但现行《中国药典》 中川芎含量测定项下仅对阿魏酸进行限定,较为单薄的指标,无法全面的评价药材质量优劣,同时文献报道［13］川芎药材中生物碱成分川芎嗪含量不足万分之一,故应测定有机酸和苯酞类等主要功效成分的含量以便客观评价和控制川芎的内在质量。但苯酞类化合物稳定性差,作为含量测定用对照品稳定性欠佳且成本较高,故本研究参考文献［14-16］,选定阿魏酸作为内标,建立洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A 和藁本内酯的相对校正因子,利用相对校正因子计算5 种成分的含量,实现一测多评。

2.5.1 色谱条件 Waters Symmetry® C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈(A) -0.5%醋酸溶液(B),梯度洗脱(0～25 min,5%～45%A；25～35 min,45%～55% A；35～45 min,55%A；45～55 min,55%～95%A；55～60 min,95%A)；体积流量1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL,理论塔板数按阿魏酸计算应不低于6 000。色谱图见图2。

2.5.2 对照品溶液制备 称取适量阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯对照品,精密称定,加甲醇制备成质量浓度分别为36.22、45.53、37.96、112.58、218.18 μg/mL的混合对照品溶液。

图2 各成分HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 供试品溶液制备 精密称取川芎粉末(过4 号筛) 0.5 g,置于锥形瓶中,加入70% 甲醇50 mL,密塞,称定质量,加热回流30 min,放冷,再次称定质量,用70% 甲醇补足减失质量,摇匀,静置,取上清液,滤过,取续滤液,即得。

2.5.4 相对校正因子测定 以阿魏酸为内标,计算不同进样量时洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A 和藁本内酯对阿魏酸的校正因子f1～f4,RSD 均小于1.5%,结果见表3。

2.5.5 方法学考察

2.5.5.1 线性关系考察 分别将混合对照品溶液稀释2、4、8、16、20 倍,在“2.5.1” 项条件下进样,以各对照品的峰面积为纵坐标(Y),进样量为横坐标(X),进行回归,结果见表4,表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分对阿魏酸的相对校正因子（n=3）Tab.3 Relative correction factors of various constituents with reference to ferulic acid （n=3）

表4 各成分线性关系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.5.2 精密度试验 取混合对照品溶液,在“2.5.1” 项条件下进样6 次,每次进样10 μL,记录各成分峰面积。结果显示,阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯RSD分别为1.19%、1.24%、2.13%、1.49%、2.13%,表明仪器精密度良好。

2.5.5.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液,在“2.5.1” 项条件下进样,分别记录0、4、8、12、2 4 h 的色谱图。结果显示,各阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯RSD 分别为 0.82%、1.16%、0.77%、1.58%、1.84%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5.4 重复性试验 精密称取同一川芎样品6份,按“2.5.3” 项下方法制备供试品溶液,在“2.5.1” 项条件下进样10 μL,记录各待测成分峰面积,计算各成分含量。结果显示,阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯RSD 分别为1.61%、1.92%、1.88%、1.02%、1.47%,表明该方法重复性良好。

2.5.5.5 加样回收率试验 精密称定已知含量的样品粉末9 份,每3 份为一组,分别加入样品中各成分含量的80%、100%、120%3 个水平的对照品溶液,进行供试品溶液制备,在“2.5.1” 项条件下进样测定。结果显示,阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯平均回收率 为 97.47%、98.91%、102.36%、99.13%、99.36%,RSD 分别为1.91%、1.79%、1.82%、1.97%、1.82%。

2.5.6 样品含量测定 在“2.5.1” 项条件下,对28 批样品进行含量测定,同时为了验证一测多评法测定结果的准确性,本研究采用常规对照品作为外标法的方法和一测多评法分别测定,结果显示2 种方法所测得的含量无明显差异,见表5,表明样品中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A 和藁本内酯的含量分别为0.071%～0.197%、0.017%～0.070%、0.015%～0.039%、0.186%～0.517%、0.986%～2.157%,平均值依次为0.132%、0.034%、0.024%、0.310%、1.554%。

表5 一测多评法和外标法所得结果比较（%）Tab.5 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method （%）

2.6 质控指标差异性分析 利用GraphPad Prism 8软件对不同等级川芎药材的各质控指标进行差异性分析,分别计算各指标在不同等级之间的分布情况并进行单因素方差分析。见图3,针对水分,一等品与二等品、三等品之间具有统计学差异 (P＜0.01),二等品、三等品与统货之间具有统计学差异(P＜0.01)；在阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A 和藁本内酯含量上,一等品与二等品、三等品及统货间有统计学差异(P＜0.05),二等品与三等品间也有统计学差异(P＜0.05)；一等品的阿魏酸松柏酯含量与三等品有统计学差异 (P＜0.05)。

2.7 质控指标的主成分分析 参考文献［17］,采用SIMCA-P 14.1 软件对在不同等级川芎药材中具有一定差异性的内在指标进行主成分分析处理,结果显示主成分分析模型的R2X=0.77,Q2=0.51,表明该模型稳定,预测能力较强,见图4。从中可以发现,4 个等级的川芎药材具有一定的区分度,其中一等品与其他3 个等级药材沿着PC1轴能明显分开,最易辨别,CX Ⅱ-1＼ -2 和CX Ⅳ-5 也归属到PC1 轴右侧,结合数据表明此区域为优质药材；二等品、三等品和统货沿着PC2 轴能明显分开,各组内差异较小,且不同等级可以较好聚集,表明综合上述5 种指标有利于对不同等级川芎药材的辨别。

图3 川芎药材质控指标的差异性分析Fig.3 Analysis on the index level difference for the quality control of Chuanxiong Rhizoma samples

图4 28 批样品主成分分析图Fig.4 Principal component analysis plot for twenty-eight batches of samples

3 讨论

中药材作为中成药的源头,其质量是否均一、稳定直接影响着最终中成药产品的质量好坏,进而影响着临床的有效性与安全性。目前大多数中药材及中成药质量标准的研究仍处于对单一或少数指标成分作定性、定量质控研究,且中药具有多组分、多靶点等特点,此质控研究模式无法全面准确反映其质量［18］,因此必须对其源头及最终产品两方面作质量标准提升,才能更有力的保证最终产品质量的优质稳定。

本研究结合目前市场上已有的川芎药材分级标准［19-20］,同时参考各国法典以及国际标准,在对川芎药材产地和市场调研的基础上,综合多种检测方法对现有4 个等级川芎药材进行检测和比较。在对不同等级川芎药材的各质控指标进行单因素方差分析时发现,水分、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A 和藁本内酯含量不同等级之间均有一定差异性。进一步通过主成分分析处理后发现,4 个等级的川芎药材具有较明显的区分,表明川芎药材商品等级的外观性状,如每千克药材所含个数等,与内在质量之间存在一定的相关性。因此,建议主要依据川芎药材的个数,质量等外观形状,并结合水分、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A 和藁本内酯含量等内在指标对该药材进行等级划分。