欧前胡素固体分散体的制备及其体内药动学研究

尚曙玉，张铁山，徐 凯，范明松

(1.黄河科技学院，河南 郑州 450063；2.上海雷允上药业有限公司技术中心，上海 201401）

欧前胡素是从蛇床、欧前胡、白芷、独活、当归等植物中提取出的活性成分［1］,属于6,7-呋喃香豆素类化合物,具有明显的抗炎、抗肿瘤、抗抑郁、扩张血管、镇痛等作用［2-3］。但该成分水溶性差［4］,药物溶出度低,从而影响其体内口服吸收的生物利用度［5］(在大鼠体内仅为7.2%［4］)。目前,已有将欧前胡素制成包合物、脂质体的报道［4,6］。

固体分散体是通过溶剂挥发法、熔融法等技术,将难溶性药物分散于亲水性载体中而得到的制剂,可增加溶解度,提高溶出率,促进药物顺利吸收并进入血液循环,从而改善生物利用度或疗效［7-12］。因此,本实验将制备欧前胡素固体分散体,并考察其体内药动学,以期为该成分或其他难溶性药物相关剂型的开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器 ME155DU 型电子分析天平 (瑞士Mettler-Toledo 公司)；UM-1 型超薄磁力搅拌器、US10300D 型超声仪、UVS-1 小型漩涡混合仪、UGC-12MF 型氮气吹干仪(北京优晟联合科技有限公司)；Agilent 1260 型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)；THZ-82 型往返恒温振荡器(江苏金怡仪器科技有限公司)；D8 Advance 型X 射线粉末衍射仪(瑞士Bruker 公司)；螺口带盖离心管(南京瑞尼克科技开发有限公司)。

1.2 试剂与药物 欧前胡素 (批号110826-201812,纯 度 98.9%)、异欧前胡 素 (批 号110827-201810,纯度98.6%) 对照品(中国食品药品检定研究院)。欧前胡素原料药 (批号1805108-1T,纯度＞98%,宝鸡辰光生物科技有限公司)。聚乙烯吡咯烷酮K30 (PVP K30,批号25000240379,美国Ashland 公司)；PEG 4000 (批号160302)、PEG 6000 (批号171005) (上海凌峰化学试剂有限公司)；泊洛沙姆188 (批号PJ171105T,江苏省海安石油化工厂)。

1.3 动物 SD 大鼠,雌雄兼具,体质量约为300 g,购于河南省实验动物中心,动物生产许可证号SCXK (豫) 2016-0002。

2 方法与结果

2.1 欧前胡素含量测定

2.1.1 色谱条件 Hypersil BDS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈-水(55 ∶45)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长300 nm；进样量20 μL。

2.1.2 线性关系考察 精密称取欧前胡素对照品10 mg,溶于50 mL 乙腈中,得到0.2 mg/mL 贮备液,“2.1.1” 项下流动相稀释至40、10、1.0、0.1、0.05 μg/mL,各6 份,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以欧前胡素质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y) 进行回归,得方程为Y=18.028 2X+0.905 8 (r=0.999 8),在0.05～40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 方法学考察 取欧前胡素固体分散体约10 mg,溶于100 mL 稀释液中,于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得欧前胡素峰面积RSD 为0.82%,表明溶液在48 h内稳定性良好。平行制备6 份供试品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得欧前胡素峰面积RSD 为1.04%,表明该方法重复性良好。取高(40 μg/mL)、中(10 μg/mL)、低(0.05 μg/mL)质量浓度对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次,测得欧前胡素峰面积RSD 分别为0.11%、0.16%、0.12%,表明仪器精密度良好。精密称取欧前胡素含量已知的供试品溶液,置于100 mL 量瓶中,加入对照品溶液,“2.1.1” 项下流动相稀释定容至刻度,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定9 次,测得欧前胡素平均加样回收率分别为100.18%,RSD 为1.53%。

2.2 体外溶出度试验 采用2020 年版《中国药典》 四部通则0931 桨法。设置溶出仪温度、转速分别为37 ℃、100 r/min,900 mL 0.5% SDS 溶液作为释放介质,于10、15、20、30、60、90、120 min各取样3 mL,并立即加入3 mL 空白0.5%SDS 溶液,0.45 μm 微孔滤膜过滤,在“2.1.1”项色谱条件下进样测定,并计算各时间点累积释放度。

2.3 欧前胡素固体分散体制备 泊洛沙姆188、PEG 4000、PEG 6000 熔点较低,一般采用熔融法制备固体分散体［13］,而PVP K30 熔点较高,并可溶于无水乙醇等有机溶剂,故本实验采用溶剂挥发法制备。称取20 mg 欧前胡素和一定量PVP K30(药载比1 ∶3、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶9),置于有转子的圆底烧瓶中,加入30 mL 无水乙醇后置于45 ℃水浴中,持续搅拌3 h 得澄清溶液,45 ℃下减压旋蒸后得残留物,置于45 ℃真空干燥箱中过夜,即得PVP K30 欧前胡素固体分散体,研细,过24目筛。

同时,制备PEG 4000 欧前胡素固体分散体。称取20 mg 欧前胡素和一定量PEG 4000 (药载比1 ∶3、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶9) 于烧瓶中,在65 ℃水浴中搅拌1.5 h 得熔融液,立即置于-30 ℃超低温冰箱中保存30 min,置于干燥器中过夜,研细,过24 目筛,即得。同法制备PEG 6000、泊洛沙姆188 欧前胡素固体分散体。

2.4 体外溶出研究 图1 显示,PVP K30、泊洛沙姆188、PEG 4000、PEG 6000 欧前胡素固体分散体均可促进药物溶出,在一定时间内随着载体比例增加,其溶出率、累积溶出度逐渐升高,以PVP K30 为载体时累积溶出度最高,达94.26%。由于药载比1 ∶8、1 ∶6 时各时间点累积溶出无明显差异,故最终选择PVP K30 作为载体,药载比为1 ∶6。

2.5 晶型分析 取欧前胡素、PVP K30、物理混合物(药载比同固体分散体)、固体分散体粉末适量,置于样品槽中,玻璃片压平后进行扫描,设置条件为铜靶；管压40 kV；管流200 mA；扫描速度5°/min；扫描范围(2θ) 3°～45°,结果见图2。由此可知,欧前胡素、物理混合物X 射线衍射(XRPD) 图谱中均有大量晶型衍射峰,但固体分散体中未发现,表明欧前胡素转变成为无定型状态。

2.6 表观溶解度测定 取过量固体分散体、物理混合物、欧前胡素加到蒸馏水中,采用恒温摇床法在25 ℃下振荡平衡48 h,静置1 h 后取上层溶液,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取滤液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,结果见表1。由此可知,固体分散体可将欧前胡素的表观溶解度提高14.39 倍。

图1 欧前胡素固体分散体溶出曲线Fig.1 Dissolution curves for imperatorin solid dispersions

2.7 体内药动学研究 参考文献［14］ 报道。

2.7.1 灌胃液制备 取欧前胡素适量,0.3%CMC-Na 溶液制成4 mg/mL 混悬液；取固体分散体适量,蒸馏水制成含4 mg/mL 欧前胡素的混悬液,即得,临用现配。

图2 样品XRPD 图谱Fig.2 XRPD patterns for samples

表1 样品表观溶解度测定结果（n=3）Tab.1 Results of apparent solubility determination of samples （n=3）

2.7.2 分组、给药与血样采集 12 只大鼠饲养于温度25 ℃、相对湿度45%条件下,实验前1 d 禁食不禁水,随机分为欧前胡素组和固体分散体组,按25 mg/kg 剂量灌胃给予“2.7.1” 项下相应灌胃液,乙醚麻醉后于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 眼眶取血各约0.3 mL,置于肝素浸润离心管中,棉球止血,血样摇匀后2 500 r/min 离心2 min,吸取上层血浆,置于-20 ℃冰箱中保存。

2.7.3 血浆样品处理 选择乙酸乙酯作为提取溶剂,密封备用。取解冻后血浆样品100 μL,置于螺口带盖离心管中,加入内标溶液50 μL、提取溶剂1.5 mL,涡旋5 min 后5 000 r/min离心10 min,分取乙酸乙酯-石油醚层,45 ℃下氮气吹干得残渣,加入100 μL 乙腈-水(55 ∶45) 混合液复溶,5 000 r/min 离心10 min 后待测。

2.7.4 线性关系、专属性考察 称取10.0 mg 异欧前胡素对照品,溶于100 mL 乙腈中并稀释至500 ng/mL,即得内标溶液。取“2.1.2” 项下对照品溶液,乙腈稀释至2 000、1 000、500、250、100、50 ng/mL,分别精密吸取500 μL,45 ℃氮气吹干后再加入500 μL 空白血浆,即得2 000、1 000、500、250、100、50 ng/mL 血浆对照 品溶液。

量取100 μL 的不同质量浓度血浆对照品溶液,加入50 μL 内标溶液,按“2.7.3” 项下方法处理,在“2.1.1” 项色谱条件下进样20 μL 测定。以欧前胡素与内标(异欧前胡素) 峰面积比值为纵坐标(Y),欧前胡素质量浓度为横坐标(X)进行回归,得方程为Y=248.33X+14.687 2 (r=0.992 3),在50～2 000 ng/mL 范围内线性关系良好。

取空白血浆、样品溶液(加内标)、血浆对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,结果见图3。由此可知,欧前胡素、异欧前胡素分别在6.2、7.3 min 出峰,血浆内源性物质不干扰测定,表明该方法专属性良好。

图3 欧前胡素HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of imperatorin

2.7.5 方法学考察 血浆样品在室温下自然融冻后,于0、2、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得欧前胡素与内标(异欧前胡素) 峰面积比值的RSD 为7.17%,表明溶液在24 h 内稳定性良好。取 低(100 ng/mL)、中(1 000 μg/mL)、高(2 000 μg/mL) 质量浓度血浆对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下各进样测定3 次,测得其日内、日间精密度RSD 分别小于9.65%、10.85%,表明该方法精密度良好。取上述3 种质量浓度血浆对照品溶液,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得欧前胡素相对回收率为86.06%～93.55%。取不含内标的欧前胡素血浆对照品溶液逐步稀释,在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定,测得定量限(S/N=10)、检测限(S/N=3) 分别为4、2 ng/mL。

2.7.6 药动学研究 图4、表2 显示,与原料药比较,固体分散体tmax缩短 (P＜0.05),Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P＜0.01),相对生物利用度增加至2.03 倍,表明固体分散体可促进欧前胡素体内吸收。

图4 欧前胡素血药浓度-时间曲线Fig.4 Plasma concentration-time curves for imperatorin

表2 欧前胡素主要药动学参数（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for imperatorin（， n=6）

表2 欧前胡素主要药动学参数（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for imperatorin（， n=6）

注:与欧前胡素比较,*P＜0.05,**P＜0.01。

3 讨论

欧前胡素水溶性较低,仅为11.82 μg/mL,会导致其体内溶出受限、口服吸收生物利用度低下,而该成分脂质体的制备工艺较复杂,包封率仅为57.32%［8］。大量研究表明,包合技术可增加药物溶解度及生物利用度［15］,但包合物对酸不稳定,存在有机溶剂残留缺陷(包合作用)［16］,而且环糊精包合物在体内会转化为葡萄糖,对糖尿病患者不利。本实验采用制备工艺相对简单的固体分散体技术,可改变欧前胡素存在形式,由结晶型转化为溶解度更好、溶出速率更快的无定型状态［17］。

在药动学研究中,本实验采用液-液萃取法(乙酸乙酯) 进行血浆样品处理,方法学考察结果显示,其回收率较高,并且无干扰。固体分散体组tmax提前,可能与它大大提高了药物溶出率有关［12］；与原料药比较,固体分散体Cmax提高了1.96 倍,相对生物利用度提高了2.03 倍,可能与它增加药物溶解度和溶出度,促进药物吸收有关。

欧前胡素难以吸收进入血液循环,除了与其本身溶解度较差、难于溶出等原因外,还可能受到胃肠道酶代谢、肠道pH 环境等因素的影响［18-20］,导致药物发生降解。尽管固体分散体解决了欧前胡素溶解度、溶出度等吸收瓶颈问题［21］,但对该成分在胃肠道稳定性方面的改善作用可能较小,生物利用度的提高程度会受到一定限制,今后将继续对此加以研究。