ELPs标签纯化重组蛋白的研究进展

姜 媛，丁 宁，胡学军*

(1.大连大学医学院，辽宁 大连 116000；2.大连大学 医学研究中心，辽宁 大连 116622)

目前，重组蛋白已被广泛应用于临床治疗、医学检验、环境监测等领域[1]。低成本高效的纯化重组蛋白是蛋白生产的关键技术。通常采用各种色谱柱进行蛋白质纯化，该方法同时需要辅助设备，比如蛋白质分离纯化系统[2]。而类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides，ELPs)的出现给纯化重组蛋白提供了新的途径。

1973年，Urry等发现天然弹性蛋白疏水区域中含有大量的Val-Pro-GIy-Val-Gly(VPGVG)重复氨基酸序列[3]。ELPs是根据重复五肽氨基酸序列人工合成的温度敏感的蛋白质聚合物(VPGVG)n，具有响应温度变化的可逆相变性质[4-6]。因此，近年来ELPs因其具有明显的可逆相变特性而备受关注[7]。ELPs在低于其可逆相变温度(inverse transition temperature，ITT)下可溶于水溶液，但在高于ITT时变成不溶性聚集体[8]。随机的单个ELPs链在达到ITT之前，随着温度的升高开始呈现β-转构象，接着是β-螺旋构象，然后在达到ITT时相互堆叠形成 “扭曲的细丝”并相互结合形成不溶性聚集体。此过程是可逆的，当温度降低到ITT以下时，聚集体重新溶于溶液中[9](图1)。

图1 ELPs可逆相变机理Fig.1 Inverse transition mechanism of ELPs

研究[10-13]发现，当ELPs基序与另一蛋白融合时，ELPs的可逆相变性质得以维持。由此推断ELPs允许重组蛋白的非色谱热刺激相分离。自此ELPs便作为纯化标签参与蛋白质纯化。虽然ELPs标签与现有纯化标签均可用于标准化重组蛋白的纯化过程，但现有纯化标签的一个共同缺点是：大多数依赖于亲和层析，成本较高，特别是大规模制备时。相比之下，ELPs标签的纯化过程简单而直接，可以显著降低重组蛋白的生产成本[14]。Hassouneh团队[2]将ELPs作为一种纯化标签，当加热到温度低于ITT时，采取多次可逆相变循环(inverse transition cycle,ITC)技术成功纯化了ELPs融合蛋白。到目前为止，ITC技术已成功用于纯化不同种类蛋白质[10,12,15]。ITC技术主要是依据ELPs标签特有的可逆相变特性[16-17]，通过改变ITT来改变ELPs重组蛋白的状态(图2)。该过程需要适当的溶液环境，通常添加盐溶液，如NaCl溶液(1～3 mol·L-1)、硫酸铵溶液(0.4～1.0 mol·L-1)或柠檬酸钠溶液(0.15～0.50 mol·L-1)[18],然后进行升温以诱导ELPs重组蛋白聚集沉淀和离心，随后降温，在所需缓冲液中再次溶解沉淀蛋白。在大多数情况下，两到三轮的升温离心步骤足以纯化得到所需的蛋白质。ITC技术不需要昂贵的色谱设备、树脂和试剂，仪器配置简单，仅用常规离心机或过滤装置即可，并且所得蛋白质的纯化量及纯度与亲和色谱所得的基本一致。因此,ITC技术是一种非常经济有效且易于放大的纯化技术。作者对ELPs标签相变条件的优化、ELPs标签与靶蛋白重组方式的优化、ELPs标签的切除及ELPs标签在纯化重组蛋白中的应用的研究进展进行综述。

图2 采用ITC技术纯化ELPs标签蛋白示意图[3]Fig.2 Schematic diagram for purification of ELPs tag protein by ITC technique[3]

1 ELPs标签相变条件的优化

最常用的ELPs有五肽序列(VPGXG)n，其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸占据的客体残基，既可以是单个氨基酸，也可以是氨基酸的组合，n表示实现所需的ELPs链长度。在ELPs设计中，ELPs的客体残基组成和长度是两个正交的参数，可以用来控制ITT[16，19]。亲水性客体残基会提高ITT，而疏水性客体残基会降低ITT。脯氨酸不能用作客体残基，因为它破坏了ELPs的可逆相变性质[20]。对于相同五肽重复序列组成的不同长度ELPs，ELPs长度和分子质量增加会导致ITT降低[8]。ELPs的浓度也会对ITT造成影响，随着ELPs浓度的增加，ITT呈对数式降低[21]。同时在溶液环境中，溶液中盐浓度和溶液pH值也会影响ELPs的ITT。由于水分子和疏水基团之间的极性越强，疏水水合作用越弱，因此提高有序化的共溶剂盐的浓度也会降低ITT[22-23]。当溶液pH值为客体氨基酸的pKa值时，蛋白离子化残基部分最少，ITT最低[24]。ELPs标签的ITT选择对目标蛋白分离纯化过程十分重要。若ELPs标签的ITT太高，加热温度过高容易影响目标蛋白的稳定性，导致其在高温条件下发生变性。同时客体残基的性质也会对ITC技术中杂蛋白的产生量造成影响,疏水性太强的客体残基ELPs标签产生更多的杂蛋白[2]。因此，应优先选择在较温和条件下就可进行高效分离重组蛋白的短肽ELPs标签。表1为几种已成功广泛应用于重组蛋白纯化的ELPs标签。

表1 几种已用于重组蛋白纯化的ELPs标签

2 ELPs标签与靶蛋白的重组方式的优化

ELPs在N-或C-末端与靶蛋白的融合基因水平使它们易于被开发为廉价的实验室非色谱纯化技术[14,27]。靶蛋白的融合点与ELPs融合蛋白的表达水平和表达活力有关系。ELPs标签在目标蛋白的C端或N端没有固定的模式可循，如果目标蛋白的表达水平很高，ELPs标签在N端可能会干扰目标蛋白的正确折叠。在这种情况下，将ELPs标签设计到靶蛋白的C端可能更合适。如果目标蛋白的表达水平相对较低，ELPs标签设计在目标蛋白的N端，从而增强靶蛋白的可溶性表达。它可能通过与未折叠的目标蛋白形成疏水作用，防止蛋白质聚集，促进折叠，最终维持ELPs的空间构象[28-29]。在优化ITC的过程中，发现当ELPs标签在目标蛋白的C-末端融合时，其蛋白质产量比在目标蛋白的N-末端融合时高出约50%～90%[30]。

3 ELPs标签的切除

与其它纯化标签类似，ELPs标签需要在纯化后从目标蛋白中分离出来。最初通过在ELPs标签和特定靶蛋白之间设计蛋白酶切割位点来实现。相关实验表明，在融合蛋白中插入烟草蚀刻病毒(tobacco etch virus,TEV)或重组蛋白识别位点，在最终的纯化步骤后利用蛋白酶来切断酶识别位点，这一步骤将遵循附加温度循环步骤，最终将ELPs标签从目标蛋白中切除。尽管这一过程简单有效，但蛋白酶位点的残留氨基酸仍留在目标蛋白上，这可能导致免疫原性问题或影响蛋白活性[31-33]。

内含肽的发现给ELPs标签的切除提供了新思路。常用的内含肽系统有两种：一种是基因工程筛选的变异小分子内含肽，利用特定pH值和温度可以引发其C-末端发生快速的自身剪切反应；另一种是天然小分子内含肽，在反应体系中加入硫醇后，在其N-末端可以发生自我剪切反应。内含肽系统大幅度地提高了ELPs标签特异性切除效率[26，34-35]。这两种内含肽系统通过渗透压、pH值和温度的变化或硫醇的加入，可以同时启动选择性的可逆沉淀反应和内含肽自裂反应[36]。与传统的蛋白酶切ELPs标签方法相比，避免了酶切反应过程缓慢和切除反应后分离蛋白酶的过程，这不仅大幅度降低了分离纯化成本，并且提高了重组蛋白的纯化效率。但使用这种方法，需要评估pH值变化或硫醇添加对最终蛋白质的物理、化学性质产生的影响及其它任何可能性。

4 ELPs标签在纯化重组蛋白中的应用

4.1 简化蛋白质的纯化过程

融合标签技术的最初设计是依据目标蛋白与纯化基质之间不发生任何直接的相互作用，来避免发生蛋白质变性的可能性，最终用于纯化重组蛋白[37-41]。现实验室常用亲和层析、离子交换层析、疏水层析等层析技术分离纯化重组蛋白[42]。其中亲和层析是最为高效的分离纯化方法，其原理为偶联特异亲和配基吸附介质、分离纯化目标蛋白[43]。 常用于亲和层析的纯化标签谷胱甘肽巯基转移酶蛋白、钙调蛋白结合肽、FLAG标签、S肽标签等虽然可以满足大多数生物应用需求，但都对融合蛋白展示了高的特异性,同时用于固定其配基蛋白的树脂成本较高,而且结合能力较低，操作费时，因此生产成本较高，并不适用于大规模生产。短肽ELPs纯化标签与其它标签相比有很明显优势:其纯化目标蛋白采取ITC技术，利用ELPs融合的蛋白质的可逆溶解度和可溶性-不溶性相变行为纯化目标蛋白。ITC技术不仅成本低，而且效率高，极大地简化了纯化过程，所以ITC技术可应用于较大规模生产纯化重组蛋白。

4.2 提高重组蛋白的产量

由于外源蛋白对于宿主菌的异质性,当外源蛋白在宿主菌内表达时,宿主菌会产生保护性反应，即调动各种机制来阻止外源蛋白过量表达，导致目标蛋白表达量降低[42]。相关实验表明，当外源蛋白融合ELPs纯化标签后,能有效提高重组蛋白的产量。到目前为止,ELPs纯化标签通过ITC技术可应用到不同宿主中进行表达纯化重组蛋白,见表2。

表2 在不同表达系统中的ELPs融合蛋白

ELPs融合蛋白经内质网修饰后形成双层膜包被的蛋白体，从而避免了正常的生理降解。表达的ELPs融合蛋白会逐渐积累在细胞中，大大提高了目标蛋白的表达量[50-51]。Meyer团队[8]利用His6 纯化标签和不同分子量ELPs纯化标签(9 kDa和36 kDa)纯化硫氧还蛋白，其短肽ELPs纯化标签的蛋白表达量[(137±21) mg·L-1]高于传统His6纯化标签的蛋白表达量[(93±13) mg·L-1]。

5 展望

ELPs具有可逆相变的性质，温度低于ITT时保持可溶性，温度高于ITT时可逆地形成聚集体，并且与其它蛋白融合表达时，ELPs的可逆相变特性保持不变；同时由于ELPs来源于原弹性蛋白，因此具有生物相容性、无毒性和非免疫原性。ELPs的独特性质使其成为一类理想的融合标签，可在蛋白质纯化等生物、医学方面应用。ELPs标签纯化过程简单且经济，主要包括在ELPs的ITT上下循环蛋白质，然后离心获得目标蛋白，无需进行层析。但研究发现，pH值触发的ITC技术似乎更简单、更有效，省略了加热和冷却循环，但在不同pH值环境下ELPs的重组蛋白有可能发生生理性溶解。此外，虽然已有大量的研究表明ELPs融合标签在蛋白质纯化中的有效性，并且短肽ELPs标签已被证明适用于在4～37.5 ℃的不同盐中的蛋白质生产和纯化，但是目前该技术还没有完全发展到可以大规模生产应用阶段。关于ELPs标签是否会影响目标蛋白的翻译后修饰、产量和活性，及残留氨基酸(在ELPs标签被切除后可能残留)对靶蛋白活性和免疫原性的影响方面仍然需要进一步研究。

综上，尽管目前需要继续评估ELPs标签对大规模蛋白质纯化时所用设备、体积和系统等方面的可扩展性问题，但是该技术在快速、低成本、大规模生产蛋白质方面有巨大的应用潜力。总而言之，ELPs标签将会在生产生物活性靶蛋白和大规模纯化目标蛋白方面有更广泛的应用，同时也为进一步实现更低的材料成本和更简化的操作步骤提供了新思路。