桃金娘果单宁提取工艺优化及抗氧化活性研究

徐阳纯，许泽群，李栩欣，彭焱辉，王志强

(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州510070)

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa)是桃金娘科、桃金娘属植物，是一种常绿灌木，最高达2 m，主要生长于我国东西南部，南方各省皆有分布，喜生于低海拔的丘陵坡地，为酸性土指示植物，耐旱好光；国外主要分布于菲律宾、马来西亚、印度尼西亚、印度、泰国、斯里兰卡、日本等地[1-2]。桃金娘可用于水土保持、山坡复绿。桃金娘全株可入药，据记载，根能活血、通络，果能收敛、补虚，叶能祛风、安神。

桃金娘果含黄酮类、酚类、氨基酸和糖类。单宁又称多酚，是植物体内的复杂酚类次生代谢产物，具有多元酚结构[3-5]。目前，单宁的常用提取方法主要有浸提法、超声波提取法、超临界CO2萃取法、微波提取法、亚临界水萃取法、半仿生提取法等[6-10]。其中浸提法具有操作简单方便、成本低、无需特殊设备等特点，应用较广泛，但也存在耗时长、提取效果易受外界环境影响等问题；超声波提取法是利用超声波所产生的强烈振荡空化效应，使细胞膜和细胞壁的植物组织破裂，通透性提高，加速了植物细胞中有效成分进入溶剂，提高提取率，该法具有耗时短、能耗低等特点。

作者通过水浴回流浸提的方式，在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken设计响应面实验优化桃金娘果单宁的提取工艺，并采用磷钼络合物法评价桃金娘果单宁粗提液的抗氧化活性，为桃金娘果单宁的开发提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

桃金娘果，减压低温烘干、粉碎、过80目筛。

没食子酸标准品(含量90.8%)，中国食品药品检定研究所；钨酸钠、钼酸钠、无水碳酸钠、无水乙醇均为分析纯；实验用水为去离子水。

UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；BSA224S型电子天平，Sartorius公司；高速多功能粉碎机，永康久品工贸有限公司；WBK-4B型电热恒温水浴锅，广东环凯微生物科技有限公司；电热鼓风干燥箱、真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 显色剂钨酸钠-钼酸钠混合溶液(Folin-Denis)的配制

称取50.0 g钨酸钠、12.5 g钼酸钠置于烧杯中，用300 mL去离子水溶解，加入25 mL磷酸、50 mL盐酸，混合均匀后回流2 h；再加入75.0 g硫酸铝，滴加几滴溴水后继续加热15 min；待溶液冷却至室温后，定容于500 mL容量瓶中，用中速定性滤纸过滤，滤液保存于棕色瓶中。测定时使用50%浓度溶液显色。

1.2.2 稳定剂碳酸钠溶液的配制

称取75.0 g无水碳酸钠置于烧杯中，加入900 mL去离子水，用玻璃棒搅匀溶解，静置，待溶液冷却至室温后，定容于1 000 mL容量瓶中。

1.2.3 没食子酸标准溶液的配制

准确称取适量没食子酸标准品，配制成浓度为1 000 μg·mL-1的没食子酸标准母液；再吸取5.00 mL母液，稀释并定容于100 mL容量瓶中，混匀，即得50 μg·mL-1没食子酸标准溶液。

1.3 桃金娘果单宁的提取

精密称取适量桃金娘果，按一定料液比加入一定体积分数的乙醇溶液。在一定水浴温度下提取一定时间，进行两次回流提取后，过滤，滤液定容于50 mL容量瓶中。吸取10.0 mL粗提液于4 000 r·min-1离心5 min，取上清液备用。

1.4 单宁提取率的测定

1.4.1 没食子酸标准曲线的绘制

分别精密吸取0 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL没食子酸标准溶液置于10个比色管中；加入2.0 mL显色剂Folin-Denis和2.0 mL稳定剂碳酸钠溶液，用去离子水定容至10 mL，摇匀，静置1 h后，测定758 nm处吸光度，参比试剂作空白。以没食子酸含量(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程：A=0.0099c+0.0746，相关系数R2=0.9985。

1.4.2 单宁提取率的计算

精密吸取粗提液上清液于10 mL比色管中，按1.4.1方法测定758 nm处吸光度，计算单宁提取率。

1.5 提取工艺优化

1.5.1 单因素实验

采用单因素实验，分别考察水浴温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100，g∶mL，下同)、水浴时间(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min)、乙醇体积分数(0%、20%、40%、60%、80%、100%)对单宁提取率的影响。

1.5.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，选取影响单宁提取率的4个因素料液比、乙醇体积分数、水浴时间、水浴温度，采用Box-Behnken设计响应面实验，因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

1.6 抗氧化活性的测定

配制9种含量梯度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45，mg·mL-1)的桃金娘果单宁粗提液和阳性对照溶液(VC溶液和单宁酸溶液)。准确移取各浓度溶液1.0 mL置于10 mL比色管中，分别加入2 mL 0.6 mol·L-1H2SO4溶液，摇匀后，继续加入2 mL 3.5%(四水合)钼酸铵溶液和2 mL 0.65 g·L-1磷酸三钠溶液，定容至10 mL后，置于95 ℃水浴锅中水浴1 h，取出冷却，测定695 nm处吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 水浴温度对单宁提取率的影响

以60%乙醇溶液为提取溶剂，在料液比为1∶60、水浴时间为1.5 h的条件下，考察水浴温度对单宁提取率的影响，结果见图1。

图1 水浴温度对单宁提取率的影响Fig.1 Effect of water-bath temperature on extraction rate of tannin

由图1可以看出，随着水浴温度的升高，分子间的热运动加快，单宁提取率逐渐升高，当水浴温度为70 ℃时，单宁提取率达到最高；继续升高水浴温度，提取率稍有下降并趋于稳定。这是因为，水浴温度过高导致聚合单宁液化而失去活性[11-12]。因此，水浴温度以70 ℃较为适宜。

2.1.2 料液比对单宁提取率的影响

以60%乙醇溶液为提取溶剂，在水浴温度为70 ℃、水浴时间为1.5 h的条件下，考察料液比对单宁提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对单宁提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of tannin

由图2可以看出，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，单宁提取率先逐渐升高后趋于稳定。这是因为，料液比较大时，提取溶剂用量较少，桃金娘果中的单宁没有充分溶解，仍有残留，因而提取效果差；随着提取溶剂用量的增加，料液之间的接触面积增大，物料充分浸润，桃金娘果中的单宁成分有利于扩散到溶剂中，当料液比为1∶60时，溶剂与单宁的扩散已达到饱和状态，单宁已完全溶出，继续增加提取溶剂用量，单宁量也不会增加[13-16]。因此，料液比以1∶60较为适宜。

2.1.3 水浴时间对单宁提取率的影响

以60%乙醇溶液为提取溶剂，在料液比为1∶60、水浴温度为70 ℃的条件下，考察水浴时间对单宁提取率的影响，结果见图3。

图3 水浴时间对单宁提取率的影响Fig.3 Effect of water-bath time on extraction rate of tannin

由图3可以看出，随着水浴时间的延长，桃金娘果单宁提取率先逐渐升高后趋于稳定。这是因为，提取初期，有效成分浓度差大，随着水浴时间的延长，单宁更容易析出，当水浴时间为90 min时，溶剂中有效成分浓度差小，基本已达到饱和状态，提取率保持稳定。因此，水浴时间以90 min较为适宜。

2.1.4 乙醇体积分数对单宁提取率的影响

在料液比为1∶60、水浴温度为70 ℃、水浴时间为90 min的条件下，考察乙醇体积分数对单宁提取率的影响，结果见图4。

图4 乙醇体积分数对单宁提取率的影响Fig.4 Effects of volume fraction of ethanol on extraction rate of tannin

由图4可以看出，乙醇体积分数对单宁提取率影响较大，随着乙醇体积分数的增大，单宁提取率先升高后降低，当乙醇体积分数为60%时，单宁提取率达到最高。可能是因为，高体积分数的乙醇溶液对单宁的溶解减弱[13-16]。因此，乙醇体积分数以60%较为适宜。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计与结果(表2)

表2 响应面实验设计与结果

2.2.2 方差分析与显著性检验

运用Design Expert软件对表2数据进行拟合，得到二次多项回归方程为：Y=2.19-0.024A-0.036B+0.029C-0.148D+0.073AB-0.033AC-0.017AD+0.058BC+0.023BD-0.037CD-0.18A2-0.19B2-0.16C2-0.16D2。

回归模型的方差分析见表3，单宁提取率的残差分布见图5。

表3 方差分析

图5 单宁提取率的残差分布Fig.5 Residual distribution of extraction rate of tannin

由图5可以看出，29个实验点基本分布在一条直线上，表明各测得值之间相关性好，该模型可以很好地反映各因素与单宁提取率之间的真实关系，该回归方程能够对响应值进行预测分析[17-18]。

2.2.3 响应面结果分析与优化

各因素交互作用对单宁提取率影响的响应面图见图6。

图6 各因素交互作用对单宁提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface map for effect of interaction between each factor on extraction rate of tannin

由图6可以看出，响应面实验优化得到的桃金娘果单宁的最佳提取工艺条件为：料液比1∶58.3(g∶mL)、乙醇体积分数58.5%、水浴时间90.9 min、水浴温度72.2 ℃，在此条件下，桃金娘果单宁预测提取率为2.20 g·(100 g)-1。考虑实验条件的可操作性，将最佳提取工艺条件调整为：料液比1∶58(g∶mL)、乙醇体积分数60%、水浴时间90 min、水浴温度72 ℃，在此条件下进行3次验证实验，得到桃金娘果单宁平均提取率为2.24 g·(100 g)-1，与预测理论值仅相差0.04%，说明响应面法优化得到桃金娘果单宁的最佳提取工艺条件可行、可靠、可信，可为桃金娘果单宁的开发利用提供借鉴。

2.3 抗氧化活性的测定

以VC和单宁酸为阳性对照，采用磷钼络合物法评价桃金娘果单宁粗提液的抗氧化活性，结果见图7。

由图7可以看出，桃金娘果单宁有一定的抗氧化活性，随其浓度增加而逐渐增强，在浓度为0.4 mg·mL-1时，单宁粗提液的抗氧化活性分别是VC溶液、单宁酸溶液的23%、31%。分别以桃金娘果单宁粗提液、VC溶液和单宁酸溶液的浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，拟合得回归方程分别为y=0.0060+0.7587x(R2=0.9974)、y=-0.1397+3.7813x(R2=0.9941)、y=0.0763+2.2410x(R2=0.9951)。表明在一定浓度范围内，桃金娘果单宁的抗氧化活性与浓度之间存在着较好的效量关系，在0.2～0.45 mg·mL-1范围内，抗氧化活性大小依次为:VC溶液>单宁酸溶液>桃金娘果单宁粗提液。

图7 不同浓度试样的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of samples with different concentrations

3 结论

以单宁提取率为评价指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化桃金娘果单宁的提取工艺，并采用磷钼络合物法评价桃金娘果单宁粗提液的抗氧化活性。结果表明，桃金娘果单宁的最佳提取工艺条件为：料液比1∶58(g∶mL)、乙醇体积分数60%、水浴时间90 min、水浴温度72 ℃，在此条件下，桃金娘果单宁提取率为2.24 g·(100 g)-1。桃金娘果单宁具有一定的抗氧化活性，并呈剂量依赖性，可作为天然的抗氧化剂应用于食品行业中。