鞘氨醇单胞菌的特性及应用研究进展

张 颖，杨 悦，韦庆慧，赵 敏

(东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

Pseudomonaspaucimobil曾被定义为产黄色素、极性单鞭毛、非发酵的革兰氏阴性棒状杆菌，归属为假单胞菌属(Pseudomonas),其细胞脂质中含有大量独特的鞘氨醇脂和2-羟基肉豆蔻酸。而Yabuuchi等[1]研究发现，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)具有特殊的膜外成分鞘氨醇，不同于假单胞菌属，因此被重新定义为新属。1994年，Takeuchi等[2]报道Sphingomonas属于变形菌门的α亚类，是第4组的一部分。Yamamoto等[3]首次在Sphingomonas中发现了一种新的鞘氨醇脂，结构鉴定为N-2′-羟基肉豆蔻酰二羟鞘氨醇-1-葡萄糖醛酸(SGL-1)。根据16S rDNA序列的系统发育分析结果，以及细胞脂质中含有SGL-1和2-羟基肉豆蔻酸(发酵单胞菌中的非羟基肉豆蔻酸)，将其分类于一个新的鞘氨醇单胞菌科。2001年，研究者根据16S rRNA基因序列进行系统化分析，将鞘氨醇单胞菌分为四个簇，并根据系统发育、化学分类和生理学特征提出除Sphingomonas之外的三类新属：Sphingobium、Novosphingobium和Sphingopyxi，统称为Sphingomonads[4]。这三个属的模式菌分别为Sphingobiumyanoikuyae、Novosphingobiumcapsulatum和Sphingopyxismacrogoltabida。不同属所含多胺类型不同，Sphingomonas中主要含同型高亚精胺，Sphingobium、Novosphingobium和Sphingopyxi中主要含亚精胺[5]。

1 鞘氨醇单胞菌的特性

鞘氨醇单胞菌隶属于鞘氨醇杆菌目的鞘氨醇单胞菌科，需氧，革兰氏阴性，杆状，无芽孢，单鞭毛运动，能氧化戊糖、己糖和双糖产酸。该菌接触酶呈阳性，产水溶性类胡萝卜素，使其菌落一般呈黄色，但不产黄单胞菌素。所有菌株可在无机培养基中利用H2、O2、CO2等营化能自养生活，也可利用葡萄糖等作为碳源营化能异养生活[6]。最适生长温度为25～30 ℃，最适pH值为6.5～7.5。鞘氨醇单胞菌除了革兰氏反应、赖氨酸和鸟氨酸脱羧、精氨酸脱水、硝酸气体和葡萄糖发酵外，没有其它常见的生化特性。

此前鞘氨醇脂曾被认为仅是真核生物细胞膜中的重要成分之一。Bauwens等[7]通过DNA-RNA杂交技术证明Flavobacteriumcapsulatum、Flavobacteriumdevoran细胞膜与鞘氨醇脂有密切关系，因此将该类菌株独立于假单胞菌属分类。迄今为止，尚未见其它细菌物种中含有鞘氨醇脂的相关报道，故鞘氨醇脂可作为鞘氨醇单胞菌鉴定的生物化学标志物。这些物种中鞘氨醇脂的出现是确定其生物分类位置的重要化学标准，它们的脂肪酸谱由作为主要脂肪酸的C18∶1ω7c和作为主要羟基化脂肪酸的C14O2-OH组成。它们以泛醌Q-10为主要呼吸道醌，以亚精胺为主要多胺[4]。

近年来，研究者发现鞘氨醇单胞菌能够利用多种有机化合物，可在低营养条件下生长和繁殖，广泛存在于自然生境中，包括湖泊、河流、海洋及陆地等[2](表1)。

Kosako等[17]根据细菌的生长情况，对20株鞘氨醇单胞菌进行了表型和抑菌试验，图1是采用Kirby-Bauer法，利用MuellerHinton培养基Ⅱ和Sensi圆盘对36种抗菌药物的敏感性评估结果。

由图1可知，药敏试验结果也各不相同,只有菌株S.macrogoltabidus对阿莫西林-克拉维酸呈中性，其它菌株对其皆呈敏感性；所有菌株对四环素、强力霉素、米诺环素、丁氨卡那霉素均呈敏感性；只有菌株S.ursincola对庆大霉素、卡那霉素有抗性，其它菌株呈敏感性；菌株S.rosa、S.sanguinis、S.parapaucimobilis、S.macrogoltabidus对阿莫西林和氨苄西林有抗性；所有菌株均对甲氧安啶有抗性等。

表1 鞘氨醇单胞菌属不同种属信息

2 鞘氨醇单胞菌的应用

由于鞘氨醇单胞菌卓越的生物降解和生物质合成能力，在环境、农业、食品及工业生产等诸多领域具有广泛的市场应用价值[1]。自然分布的某些鞘氨醇单胞菌种类与人类健康和环境安全息息相关[18]。

2.1 鞘氨醇单胞菌的环境污染物降解作用

2.1.1 对多环芳烃的降解

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由两个或两个以上的苯环以线形排列、弯接或簇聚的方式构成的一类有毒、稠合的苯环类化合物。环境中的PAHs主要来源于煤和石油的燃烧，可随烟尘粒子排入大气，由于其自身的疏水性及低水溶性，可以迅速融入沉积环境，造成污染。在人体内对PAHs的代谢过程中往往伴随着大量自由基的产生，自由基具有很强的亲电性，极易与各种生物大分子结合，导致酶失活、蛋白质结构变化、DNA断链、脂质过氧化等一系列氧化损伤，引发人类呼吸系统、神经系统、肝脏和肾脏等组织器官的疾病[19]。PAHs可被认为是影响人类健康的主要有机污染物，危害极大。

图1 20株鞘氨醇单胞菌对36种抗菌药物的敏感性Fig.1 Sensitivity of 20 Sphingomonas strains to 36 antibacterial drugs

研究发现，鞘氨醇单胞菌对土壤中萘、联苯、间二甲苯及菲类等芳香族化合物的降解效果显著[20-23]，在PAHs生物修复中具有广阔的应用前景。其中，菲因其具有3个相连的苯环而被作为PAHs的代表，可用于评价微生物对PAHs的降解能力。Pinyakong等[24]发现鞘氨醇单胞菌对菲类物质的降解效率较高，并首次在鞘氨醇单胞菌的菲降解产物中分离到了苯并香豆素和l,5-二羟基-2-萘甲酸，证实了菲可被氢基化双加氧酶在1,2位攻击，其后的二元醇产物可在脱氢酶和间位裂解酶的催化下产生2-羟基-1-萘甲酸，经水杨酸途径进一步降解[21]。此外，也有研究者提出细菌可以通过邻苯二甲酸盐途径降解菲类物质[25-26]。如Gong等[27]发现菲与双加氧酶和脱氢酶氧化反应后，最初代谢为1-羟基-2-萘甲酸，继而转化为1-萘酚，进一步反应生成水杨酸和邻苯二酚，后者通过三羧酸循环完全矿化[28-29](图2[19])。

图2 细菌降解菲的水杨酸途径和邻苯二酚途径Fig.2 Salicylic acid pathway and catechol pathway for degradation of phenanthrene by bacteria

2.1.2 对农药残留物的降解

人工化学合成的农药具有难降解、有毒等特点，对环境污染严重，破坏生态平衡，影响农业可持续发展。

氯乙酰苯胺类除草剂(CH)是常用农药之一，对大豆、棉花或玉米田中的一年生草和阔叶杂草具有显著的出苗前控制效果。在过去的几十年中，CH已成为美国、欧洲和许多发展中国家最受欢迎的除草剂之一，其广泛使用已引起土壤和地下水的非点源污染，可能引起人类或其它动物细胞DNA损伤[30-31]。

研究[32-33]表明，采用微生物法降解农药残留物具有高效、经济、环保及无二次污染等优势，已得到广泛应用。Cheng等[34]首次报道了鞘氨醇单胞菌DC-6对CH具有有效的降解能力。Chen等[35]对CH的降解途径进行了深入研究，发现鞘氨醇单胞菌有一个共同的CH降解途径，分上游、下游和环裂三个途径(图3)。菌株DC-6降解CH的上下游途径是通过水平基因转移和基因组合进行的。在CH降解的上游途径中，与苯胺基相连的两个侧链分别脱烷基和酰胺水解。N-脱烷基酶CndABC是一种三组分的Rieske非血红素铁加氧酶系统[36]，N-脱烷基后，乙草胺转化为2-Cl-N-(2-甲基-6-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)，CmeH将其酰胺水解为2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)。乙草胺降解的下游途径由MEA的对羟基化启动；在菌株中，相应的基因被鉴定为双组分黄素依赖单加氧酶系统MeaXY。脱氨后，4-OH-MEA自发或酶法转化为2-甲基-6-乙基对苯二酚(MEHQ)[37-38]。MEHQ通过MeaAB羟基化为3-羟基-2-甲基-6-乙基对苯二酚(3-OH-MEHQ)，这是一种双组分黄素依赖性单加氧酶。DC-6利用MEA作为生长的唯一碳源，表明菌株都存在环裂生长途径。Dong等[38]研究表明，含有meaAB的恶臭假单胞菌KT2440可以利用3-OH-MEHQ作为生长的碳源。因此，环切割酶可能不是保守的蛋白质。由于3-OH-MEHQ的化学结构与羟基喹啉相似，因此在羟基喹啉的基础上提出了乙草胺降解的环裂途径。此外，环切割途径的基因并不保守，可能是由细菌降解羟基喹啉直接进化而来。该研究对微生物分解代谢途径提供了新的见解。

图3 鞘氨醇单胞菌降解CH机理Fig.3 Mechanism of degradation of CH by Sphingomonas

2.2 鞘氨醇单胞菌提取物的抗氧化衰老作用

生物抗氧化剂是指与可氧化底物相比，当其浓度较低时，可显著延迟或阻止该底物氧化任何物质[39]。抗氧化剂能减弱活性氧的破坏作用，并能减轻或逆转许多表皮毒性的疾病。因此，自由基作用的加强或延长可以抑制活性氧防御机制，促进对抗衰老。皮肤中存在各种有效的抗氧化剂，包括抗坏血酸、尿酸、类胡萝卜素和硫氢化物。除了植物和真菌等天然产物中含有抗衰老的活性物质可制成生物抗氧化剂外，研究者发现有多种细菌提取物也具有抗衰老作用[40]。其中，鞘氨醇单胞菌因胞内过氧化氢酶和氧化酶作用，产生独特的类胡萝卜素，具有抗氧化和耐受环境胁迫作用。

2.2.1 类胡萝卜素的作用

类胡萝卜素是一种辅助的聚光色素，同时也是一种保护剂，可以抵御紫外线辐射和氧自由基的毒性影响，广泛存在于多种细菌、藻类、真菌和植物中，是最显著的膜结合抗氧化剂[41]。当细菌细胞由于代谢而受到氧化应激时，在细菌细胞膜中积累的类胡萝卜素可能会抑制活性氧，减少氧扩散穿过细胞膜[42]，从而降低其致死作用。据报道，在膜中积累的类胡萝卜素还可能减少杂环插入的空间，并减少相互作用的程度[43]。另一种假设是类胡萝卜素对膜流动性有反应，这一点有待研究证实。类胡萝卜素可以防止年龄相关性黄斑变性和肿瘤的形成，作为药物具有很好的应用前景。目前，类胡萝卜素的工业化生产主要是从植物组织中提取或化学合成。因此，类胡萝卜素微生物生产系统的大规模开发具有很大的市场潜力。

2.2.2 鞘糖脂提取物的作用

衰老的最初阶段是通过持续激活p53-p21或/和p16-Rb通路，从短暂的细胞周期停滞发展到稳定的细胞周期停滞。由此产生的早期衰老细胞通过下调层粘连蛋白B1，从而触发广泛的染色质重塑，从而产生衰老相关的分泌表型(SASP)。Gervason等[44]发现鞘氨醇单胞菌提取物可抑制SA-β-半乳糖苷酶的表达和细胞周期抑制剂(p21和p16)的表达，延缓细胞衰老。同时，研究发现蛋白聚糖(versican)和原纤维蛋白-1(Fibrillin-1)经鞘氨醇单胞菌提取物处理后可使表达量增加，有效延缓衰老，促进细胞增殖以确保组织修复和吸水。Carrino等[45]比较了从胎儿到成年和衰老阶段的不同年龄组的versican变化，随着年龄的增加，versican的含量逐渐减少。而且，高含量的versican已被证明可以保护成纤维细胞免于凋亡。表明鞘氨醇单胞菌提取物具有促增殖和抗衰老作用。

2.3 鞘氨醇单胞菌与植物互作

Wang等[46]研究了鞘氨醇单胞菌(SaMR12)对非寄主植物芥菜的影响，发现在铬处理下，鞘氨醇单胞菌能在根中定植、聚集并向芽移动，提高植株耐铬能力。与未接种的植株相比，接种鞘氨醇单胞菌后不仅降低了幼苗过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量，而且降低了幼苗和根系脯氨酸含量。此外，鞘氨醇单胞菌的接种提高了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性，提高了抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环中脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)的相关基因表达水平和催化活性。SOD、POD、CAT和APX均是植物抗重金属胁迫的重要抗氧化酶[47-48]。在该研究中，铬暴露提高了芽和根中的SOD和POD活性，降低了芽中的APX活性，在低浓度铬时CAT活性升高，高浓度铬时CAT活性反而降低。在许多研究中都报道了类似的趋势[49-53]。研究表明，用鞘氨醇单胞菌-铬处理时影响AsA-GSH抗氧化系统[54]，铬处理提高了东南红豆杉根的GSH水平和GR水平[55]。结果表明，铬暴露对GSH含量和GR、DHAR表达水平有影响，而鞘氨醇单胞菌的接种提高了GSH含量，促进了GR、DHAR的表达。因此，在铬胁迫下，接种鞘氨醇单胞菌可通过降低H2O2、MDA和脯氨酸含量，提高抗氧化酶活性，调节AsA-GSH循环。这些研究为超积累植物内生细菌作为修复剂在非寄主植物中提高重金属耐性的潜在应用提供了理论依据。

3 展望

鞘氨醇单胞菌广泛存在于自然生境中，与人类生活息息相关，其在降解环境污染物、抗氧化衰老、与植物互作等领域的研究已成为当前热点。近些年，研究者已初步揭示了鞘氨醇单胞菌提取物在抗氧化方面的作用、对环境污染物降解的机理，证明了微生物应用于环境修复的可能性。研究发现，鞘氨醇单胞菌在抗氧化、抗重金属等领域中能发挥明显作用，具有开发为微生物菌剂的市场价值。但原位生物修复作用、微生物复合菌剂构建和生物安全性等问题仍需进一步研究阐明。由于该菌是近些年重新分离的新种，关于该菌细胞膜内含酸性鞘氨醇脂的形成机制尚不明确，调控产鞘氨醇脂的基因也还未知，是否借鉴了真核生物基因等问题还有待深入研究。鞘氨醇单胞菌耐受高度贫氧环境，有特殊的代谢机制，在农业、工业和医药产业的应用上具有独特市场价值，其应用前景不可估量。