黑素瘤干细胞在黑素瘤转移中的研究进展

尹起亮，于佳弘，徐 梦，杜晓雪

黑素瘤是起源于皮肤黑素细胞的一种恶性肿瘤，其恶性程度高，易转移和复发，约占皮肤癌相关死亡人数的75%[1-2]，对放疗和化疗抵抗明显。分子靶向治疗和免疫治疗虽已证实可一定程度延长患者的生存期[3-4]，但大多数患者在1年内出现耐药[5]。因此，传统的治疗方法并不能取得令人满意的疗效。近年来，随着肿瘤干细胞（tumor stem cells，TSCs）学说的兴起，已有证据显示TSCs可能是肿瘤转移的起源细胞[6-7]。TSCs是肿瘤组织中具有自我更新和分化潜能的一组细胞，由于其在体内处于相对静止状态，具有抵抗放疗和化学药物的作用，同时存在特异性表面标志物，表现出高度耐药的特性，因此TSCs被认为是引发肿瘤复发和转移的根源TSCs[8-9]。既往研究提出，肿瘤转移的实质就是TSCs的转移和归巢[10]。同样，黑素瘤干细胞（melanoma stem cells，MSCs）在黑素瘤转移中亦扮演着重要的角色。MSCs对化疗药物耐受也解释了传统的抗肿瘤药物仅能抑制或缩小肿瘤，而不能完全根除，最终还是出现肿瘤转移和复发[11-12]。虽然目前尚未完全阐明MSCs促进肿瘤转移和复发的机制[13-14]，但MSCs可以表达多种细胞标志物，包括CD133、ATP结合盒亚家族B成员5（ATP-binding cassette subfamily B member 5，ABCB5）、CD271、CD20和 乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等（表1），通过调控多种信号通路（Notch、Hedgehog和Wnt等）的激活或抑制以维持MSCs的特性，进而促进黑素瘤细胞上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）和新生血管生成，加速肿瘤的转移[14-16]（图1）。因此，进一步研究MSCs在黑素瘤的侵袭和转移中的作用，对于探寻黑素瘤的有效治疗方法至关重要。

表1 MSCs标志物的作用Table 1 Mechanism of MSCs markers

Fig.1 Melanoma stem cells (MSCs) account for only a small part of melanoma cells,which express a variety of cell markers such as CD133,ATP-binding cassette subfamily B member 5 (ABCB5),CD271,CD20,aldehyde dehydrogenase (ALDH),etc.The activation of the signaling pathways (including Notch,Hedgehog and Wnt pathways) is modulated by these markers to maintain the characteristic of MSCs,thus promoting the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and angiogenesis of melanoma,and accelerating the tumor metastasis.图1 MSCs表达多种细胞标志物，通过调控多种信号通路以维持MSCs特性，促进黑素瘤细胞上皮-间质转化和新生血管生成，加速肿瘤转移

1 MSCs表面标志物调控黑素瘤转移

1.1 CD133

CD133作为一种功能未知的表面蛋白，在人黑素瘤组织中可见表达，但在正常皮肤组织中几乎检测不到[35]。已证实在包括黑素瘤在内的多种类型肿瘤中，CD133作为一种干细胞相关表面抗原与肿瘤细胞的增殖和肿瘤进展密切相关[18,36-37]。研究显示，CD133＋黑素瘤细胞可上调411个基因的表达，与血管生成、黏附和迁移密切相[38-39]。CD133＋MSCs具有启动肿瘤进展的潜力，CD133通过Notch1激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，进而调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达，促进肿瘤内皮细胞相互作用，导致肿瘤血管生成增加，促进肺转移[38,40]。此外，转移性黑素瘤中CD133、p-p38和p-MEK3/6的表达水平均明显高于癌旁组织[17,38]，提示Notch1及其调控的MAPK信号通路网络可能成为MSCs介导的黑素瘤治疗的潜在靶点[41-42]。研究发现，CD133＋和ABCB5＋MSCs参与血管周围小生境的形成，采用RNAi技术阻断CD133表达后，干细胞体内成瘤能力明显降低，并下调了与血管微环境密切相关的CD144和ABCB5分子的表达，而ABCB5-细胞失去了形成CD144＋血管生成拟态样管道的能力，证实CD133＋/ABCB5＋MSCs存在于相互吻合的CD144＋血管生成拟态样管道中，提示CD133＋MSCs可以通过促进血管生成拟态以及特定的血管微环境的形成，促进肿瘤转移[43-44]。体内研究中，ZIMMERER等[45]利用体内荧光显微镜，证实CD133＋黑素瘤D10细胞异种移植至裸鼠体内，能够触发重要的血管生成过程，而肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件。另有研究提发现，复发和转移性黑素瘤患者的CD133＋表达水平是原发性黑素瘤患者的2倍[46]。RAPPA等[41]证实CD133在人转移性黑素瘤细胞中表达下调，进而降低了黑素瘤的形成和转移潜能。此外，针对CD133不同表位的单克隆抗体显示出剂量依赖性细胞毒性[47]。因此，CD133可作为转移性黑素瘤治疗的一个潜在治疗靶点。

1.2 ABCB5

ABCB5是ATP结合盒转运蛋白家族中的一员，是细胞膜电位的一种调控因子，可以调节正常皮肤祖细胞之间的相互融合，被认为是MSCs的标志物之一[27,48]。众所周知，ABC转运蛋白通过肿瘤细胞内的药物外排介导多药耐药，这一现象通常与TSCs相关[49-50]。ABCB5作为MSCs的标志物，具有较高的致瘤能力，并与其他的MSCs标志物如CD133共表达[51-52]。临床研究显示，ABCB5可促进肿瘤进展，在色素性黑素痣组织中ABCB5的表达水平普遍较低，而在原发性和转移性黑素瘤细胞亚群中则表达增强[20,53]。已有研究证实ABCB5＋MSCs可促进黑素瘤转移[54]。MA等[55]在黑素瘤患者外周血中发现ABCB5＋黑素瘤细胞，将此种细胞移植至NOD/SCID/IL2小鼠可使其发生远处转移，且转移程度与ABCB5＋黑素瘤细胞数量成正比。FRANK等[56]证实ABCB5＋人黑素瘤细胞通过表达内皮特异性标志物和其他血管生成蛋白促进血管生成拟态形成，而血管生成拟态在黑素瘤血管新生中具有至关重要的作用[57]。同一组研究表明，人黑素瘤ABCB5＋亚群优先表达Tie1和CD144等血管生成分化标志物，ABCB5＋和CD133＋黑素瘤特异性TSCs优先表达VEGF受体1和VEGF，这对人类黑素瘤细胞的血管生成拟态至关重要，可进一步促进肿瘤转移[38,56]。有研究指出，ABCB5促进黑素瘤转移和复发的一个潜在机制是ABCB5抑制T细胞活化，使机体具有免疫侵袭能力[58]。ABCB5＋细胞亚群的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类受体、黑素瘤相关抗原、共刺激分子B7.2和程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）的表达水平均低于ABCB5-细胞，这一发现证实靶向ABCB5 MSCs标志物对黑素瘤的治疗有益，包括正在进行的针对PD-1受体的临床试验[59]。

1.3 CD271

CD271又称为低亲和力神经生长因子受体（nerve growth factor receptor，NGFR）或p75NTR，是MSCs的一种特征性的标志物[27,60-61]。研究证实，CD271＋黑素瘤细胞较CD271-细胞更具成瘤能力，且与黑素瘤在体内的转移尤其是与周围神经转移相关[62-64]。既往研究报道，CD271是用于鉴别黑素瘤异质性亚群最可靠的细胞表面标志物，CD271＋黑素瘤细胞在小鼠体内可形成肝转移和肺转移，而CD271-黑素瘤细胞则不能形成转移，并且在人类样本实验中得到了相似的结果，与原发性黑素瘤细胞株相比，转移性细胞株中CD271/Sox10阳性细胞的比例显著增 加[65-66]。SCHNEGG等[67]和VALYI-NAGY等[68]指出，血管周围小生境中有较多CD133＋和CD271＋MSCs的积累，并且形成血管生成拟态的黑素瘤细胞对CD271呈阳性表达。VALYINAGY等[68]利用免疫荧光技术检测二维和三维培养的人葡萄膜黑素瘤细胞系C918中CD271的表达，结果显示三维培养时，构成血管生成拟态管道的肿瘤细胞高表达CD271，而非血管生成拟态管道构成的细胞则不表达CD271，证实三维培养形成血管生成拟态管道的黑素瘤细胞获得了TCSs样表型，并且参与了血管生成拟态的形成。临床研究显示，晚期黑素瘤循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）中ABCB5＋CD271＋RANK＋MSCs数量显著增加，表明CTCs在MSCs中高度富集，这是导致远处继发性肿瘤形成的重要因素[69-70]。此外，CD271和ABCB5阳性黑素瘤细胞表达低水平的黑素瘤相关抗原如MART-1，这支持了表达MSCs标志物的黑素瘤细胞逃避宿主免疫系统攻击的观点[24]。体外条件下，CD271在黑素瘤细胞中的过度表达抑制了黑素瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的产生，并且CTL来源的干扰素γ反过来诱导黑素瘤细胞CD271的表达，进而下调黑素瘤抗原的产生[71]，提示表达高水平CD271＋的黑素瘤细胞与较高的肿瘤转移潜能和较差的预后相关[25,34]。

1.4 CD20

CD20是一种B细胞表面标志物，在黑素瘤细胞系中存在持续表达CD20的TSCs亚群[27,72]。既往研究显示，与黑素瘤细胞系WM115黏附细胞相比，以非黏附（黑素瘤球体细胞）形式增殖的WM115细胞表达了更高水平的CD20，而黑素瘤球状细胞移植至小鼠体内更易形成肿瘤[72]，说明CD20＋黑素瘤细胞在体内外均表现出干细胞特性[73]。与TSCs在肿瘤中仅占小部分的观点一致，CD20＋细胞仅占黑素瘤细胞总数的2%左右[20,74]，但在晚期转移性黑素瘤中，利用抗CD20单克隆抗体靶向治疗黑素瘤的疗效却较非靶向治疗的疗效更为显著[75-76]，甚至可使黑素瘤完全缓解，提示CD20＋MSCs可能是黑素瘤发生和发展的根源[76-77]。虽然目前尚无明确证据显示CD20＋MSCs直接参与黑素瘤转移，但是CD20＋黑素瘤细胞的干细胞特性已得到证实，其高致瘤性和迁移能力是导致肿瘤进展的主要原因[76,78]。因此，CD20可能成为未来黑素瘤治疗的新靶点。

1.5 ALDH

ALDH是一组可将乙醛氧化成乙酸的同工酶，是多种TSCs的标志物，并与不同类型实体瘤的多药耐药和免疫耐受相关[29,79]。ALDH是MSCs的一种细胞内标志物[14]。研究发现，高表达ALDH的黑素瘤细胞（即ALDHhigh细胞）具有MSCs的特性[80-81]。ALDHhigh较ALDHlow（ALDH 低表达的黑素瘤细胞）可以产生更多的黑素瘤克隆球体[80]，而沉默ALDH基因表达后，黑素瘤在体内的形成能力明显受抑[81-82]。CONTADOR-TROCA等[83]通过反转录病毒转导稳定下调小鼠黑素瘤B16F10细胞AhR和（或）ALDH1的表达，发现下调ALDH1表达可以抑制AhR表达缺失黑素瘤细胞的肿瘤转移，并且降低AhR敲除细胞中CD133＋/CD29＋/CD44＋细胞的数量和黑素球的大小，从而证实在AhR缺乏背景下，ALDH1过度激活可促进黑素瘤的进展。相似地，采用shRNA沉默黑素瘤细胞中ALDH1的表达后，将肿瘤接种于小鼠体内，发现沉默ALDH1的表达不仅可以显著延缓异种移植黑素瘤的形成和生长，并且显著减少转移瘤的数目和负荷[84-85]。由此可见，靶向ALDH可能是治疗晚期黑素瘤的有效策略。

1.6 其他分子标志物

Sox10是黑素细胞向恶性转化过程中的一个关键性的核转录因子，有潜力成为MSCs的标志物之一[86-87]。Sox10在黑素瘤前哨淋巴结微转移灶中的阳性率接近100%，明显高于S100、HMB45、melanA等其他黑素瘤标志物，与黑素瘤的转移密切相关[86,88]。此外，有研究发现CD271＋黑素瘤细胞的干细胞特性可能与CD271/Sox10相互作用网络有关，但具体机制尚未阐明[89]。CD133＋小鼠和人黑素瘤细胞可表达高水平的Oct3/4、Nanog和Sox10，能够促进肿瘤新生血管形成[38]，由此表明Sox10与MSCs的其他标志物可以相互调控，进而影响肿瘤的发展。

CXC趋化因子受体6（CXC chemokine receptor 6，CXCR6）也是MSCs的一种重要标志物。CXCR6＋黑素瘤细胞与ABCG2＋黑素瘤细胞相比，可在更短的时间内形成更大体积的肿瘤，并且ABCG2＋和CXCR6＋双阳性细胞较ABCG2＋或CXCR6＋单阳性细胞具有更高的致瘤潜力[90]，从而促进肿瘤转移。

CD44近年来已被作为MSCs的特异性标志物而应用于临床前研究[91]。有研究证实，阻断胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）可通过下调干细胞标志（Sox2、Oct3/4、CD44和CD133）以及干细胞功能特性，阻止黑素瘤细胞的转移行为和EMT过程[92]。由此说明，CD44在黑素瘤转移中扮演重要角色。

2 靶向MSCs特异性标志物的研究

MSCs表面标志物与其他细胞之间存在差异，具有相对特异性，因此可作为分子靶向治疗的靶点，不仅能够清除MSCs，还能够防止正常细胞受到损害，从而达到最佳的抗肿瘤疗效。组蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）抑制剂Tubacin可促进人转移性黑素瘤细胞FEMX-I释放含有CD133＋的外泌体，使细胞内CD133含量下降，进而抑制FEMX-I细胞的增殖和克隆形成能力[93]。此外，利用CD133单克隆抗体作用于FEMX-I黑素瘤细胞，发现可以通过细胞毒作用抑制黑素瘤细胞增殖，并且发现经shRNA介导下调黑素瘤细胞CD133的表达后可以减少黑素瘤的肺及脊髓转移[41]。穿心莲内酯可阻断黑素瘤细胞中Notch1依赖性CD133的表达，降低MAPK信号通路的活化水平，从而抑制肿瘤生长、血管新生和转移[38]。氧化亚铜纳米粒子可明显抑制TSCs标志物SOX10和CD271 的表达，进而加快A375和WM266-4细胞中高表达CD271的细胞凋亡，抑制其致瘤性[94]。露那辛可降低MSCs标志物ALDH和干细胞因子Nanog的表达水平，促使小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）表达上调，从而抑制肿瘤细胞的集落形成能力和异种移植肿瘤的生长，并且促进ALDHhigh向ALDHlow黑素瘤细胞转化[95]。厚朴酚可通过降低Notch2及下游靶蛋白Hes-1和cyclin D1的表达水平，下调CD271、CD166、JARID1B和ABCB5的表达，进而抑制黑素瘤细胞的生长，并诱导细胞自噬[96]。在临床试验中，抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗被应用于CD20＋转移性黑素瘤的治疗，抗CD20单克隆抗体可以消除CD20＋黑素瘤细胞，并且增加外周B细胞数量[97]。体内外黑素瘤细胞研究显示，MSCs诱导的血管生成拟态可作为抗肿瘤化合物（天然植物化学物羽扇豆醇）的一个颇具潜力的生物学靶点[98]，通过抑制血管新生而阻止肿瘤转移。然而，当前的研究主要集中在细胞和动物层面，尚缺乏大规模的临床研究给予佐证。

3 小结与展望

MSCs的研究为探索黑素瘤的转移、复发、耐药和治疗方法提供了全新的思路。MSCs在黑素瘤的发生和发展中，尤其是肿瘤的转移中扮演着重要角色，通过MSCs特异性标志物的相互作用以及对相关信号通路的调控以促进肿瘤进展。因此，全面了解肿瘤转移中的MSCs标志物及其信号转导机制尤为重要，有助于发现更多有效的黑素瘤分子靶向治疗靶点。虽然目前MSCs诱导肿瘤转移的相关研究已得到广泛关注，但仍处于初级研究阶段。随着对MSCs标志物及其相关信号转导通路的研究不断深入，相信在不远的未来，有望找到一种可以有效抑制黑素瘤转移甚至根治黑素瘤的治疗策略。