沉默RAGE对人卵巢癌细胞株增殖、凋亡能力及周期分布的影响

刘红军，谢爱香，张希杰，葛美层，朱君，孙志明

（河南省濮阳市中医院1.检验科；2.妇产科；3.病理科，河南 濮阳457000）

卵巢癌属于一种常见的妇科恶性肿瘤,在女性恶性肿瘤发病中位居第三,目前关于卵巢癌的发病机制尚不明确，大部分学者认为，卵巢癌发病与患者的年龄、精神状况、环境、遗传等相关[1]。卵巢癌患者发病较为隐匿,早期患者缺乏典型的临床症状,晚期患者表现为腹胀，下腹部出现包块，患者病程短，死亡率较高。目前手术联合化疗治疗中晚期卵巢癌，但受化疗耐药性和复发的影响，患者预后差，5年的生存率较低[2]。选择有效的参与卵巢癌发生、进展的相关分子，对患者来说具有重要意义，也是临床研究的重点。RAGE主要在多种细胞表面进行表达的分子，在多种肿瘤中均有发现，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、等过程[3,4]。研究认为，RAGE基因参与肿瘤生长过程,在肿瘤治疗中发挥着重要作用。本文旨在研究沉默RAGE对人卵巢癌细胞株增殖、凋亡能力及周期分布的影响,为临床治疗卵巢癌寻找有效的靶向治疗途径。

1 材料与方法

1.1 材料 研究细胞及主要试剂：人上皮性卵巢癌SKOV-3细胞主要由（中国典型培养物保藏中心提供）。主要试剂：CCK-8、Transwell试剂盒（碧云天生物公司提供）；Tris-HCl缓冲液（Hyclone公司）；Bcl-2、Bax、CDK4、Cyclin D1一抗（北京中山生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 15ml离心管中加入8ml的15%胎牛血清培养基给予备用,取出人上皮性卵巢癌SKOV-3细胞，37℃水浴预热培养基,液氮中将细胞取出后快速置入37℃水浴进行解冻,使用镊子将冻存管夹住后，晃动，管口高于水平面，防止污染。加入5ml的培养基进行细胞重悬，1000rmp离心处理5min，将上清液摒弃后，再次加5ml的培养基进行细胞重悬,置入培养瓶中，轻轻混合均匀，在37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养，第二天，更换培养基继续培养，观察其贴壁情况，及时更换培养基。

1.2.2 慢病毒载体构建及分组 严格按照Gen-Bank最新RAGE基因库目标序列可能出现的干扰位点,进行设计shRNARAGE。RAGE序列：5'-GA TCCGGGCCGGACAGAAGCTTGGA和5'-TCCAAG CTTCTGTCCGGCCTTTTTT-3。对照引物序列为5'-CGATACTGAACGAATCGAT-3'。正反链混合后将退火缓冲液加入其中，95℃反应4min,冷却至室温,产生双链。采用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1，将退火产物100倍稀释后，与其连接，22℃下水浴过夜保存，使用大肠杆菌DH5α给予转化，第2d选择单克隆菌落,在30μg／ml Kana的LB培养液中进行接种，200r／min离心处理，在37℃下振荡过夜保存。少量抽提质粒后使用SacⅠ酶切进行鉴定（广州复能基因有限公司），分为空白组、过表达组和沉默组。

1.2.3 细胞增殖 采用CCK-8检测细胞增殖，将各组胰腺癌在96孔板进行接种，每组为3个复孔，分别培养24h、48h和72h后给予CCK-8试剂检测，每孔中加入20μl的CCK-8，继续培养4h后，通过显微镜观察胰腺癌细胞增殖能力。

1.2.4 细胞凋亡 使用Tunel试剂盒,将采集到的单细胞悬液,使用75%酒精清洁细胞计数板和盖玻片后进行晾干备用,在1.5ml EP管中使用移液器加入5u单细胞悬液,之后再加入95u PBS进行混合均匀,取20u盖玻片和计数板缝隙一侧匀速缓慢滴下,静置时间为20s，在显微镜下观察巨噬细胞凋亡状况。

1.2.5 细胞周期 细胞培养后通过脱氧核糖核酸酶，加入Triton-X100表面活性剂，在37℃环境下水浴15min，加入碘化丙啶混合均匀后，采用流式细胞仪进行细胞周期检查，Lysis软件分析G1期、S期、G2期细胞所占百分比。

1.2.6 卵巢癌细胞增殖、凋亡、细胞周期相关蛋白表达 采用Western Blot，将采集到的标本10000×g离心处理10min，取出上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白定量,将50μg蛋白加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中,100℃加热处理5min促使蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后进行转膜，结束后取下硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中4℃下封闭1h，封闭结束后，加一抗使用0.05%~0.1% TBST给予稀释（Bcl-2、Bax、CDK4、Cyclin D1一抗为1:1000），4℃孵育过夜保存,之后使用0.05%~0.1% TBST洗膜，3次，每次为5min，加二抗使用0.05%~0.1% TBST给予稀释（1:10000），室温摇动孵育1h,最后使用0.05%~0.1% TBST洗膜,3次，每次为5min。采用DAB染色试剂盒显色，光密度扫描后进行定量分析。以GAPDH为内参。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0统计软件包进行统计分析处理。计量资料采用均数±标准差（±s）描述，三组数据比较采用F值检验，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默RAGE对卵巢癌细胞增殖情况的影响沉默组24h、48h、72h细胞增殖率低于空白组和过表达组各时间段的细胞增殖率，差异具有统计学意义（P＜0.05）。过表达组24h、48h、72h细胞增殖率高于空白组各时间段细胞增殖率，差异具有统计学意义（P＜0.05）。沉默组24h、48h、72h细胞增殖率逐渐降低，空白组和过表达组24h、48h、72h细胞增殖率逐渐升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 沉默RAGE各时间段卵巢癌细胞增殖情况比较（%，±s）

表1 沉默RAGE各时间段卵巢癌细胞增殖情况比较（%，±s）

组别 24h空白组过表达组沉默组F P 18.72±4.62 20.46±4.62 16.95±5.16 3.265 0.002 48h 23.35±5.06 26.26±6.02 13.86±2.62 8.959 0.001 72h 28.35±7.11 31.69±10.85 10.34±1.45 9.252 0.001

2.2 沉默RAGE对卵巢癌细胞凋亡情况的影响沉默组24h、48h、72h细胞凋亡率高于空白组和过表达组各时间段的细胞凋亡率,具有统计学差异（P＜0.05）。过表达组24h、48h、72h细胞凋亡率低于空白组各时间段细胞凋亡率,差异具有统计学意义（P＜0.05）。沉默组、空白组和过表达组24h、48h、72h细胞凋亡率逐渐升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 沉默RAGE各时间段卵巢癌细胞凋亡情况比较（%，±s）

表2 沉默RAGE各时间段卵巢癌细胞凋亡情况比较（%，±s）

组别空白组过表达组沉默组F P 24h 48h 18.46±4.46 12.28±3.35 20.45±6.62 5.223 0.001 20.44±4.85 16.15±3.56 30.64±10.12 6.407 0.001 72h 25.39±6.05 18.85±5.38 48.95±10.16 12.419 0.001

图1 各组卵巢癌细胞凋亡情况（DAB染色，200×）

2.3 沉默RAGE对卵巢癌细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响 沉默组Bcl-2蛋白表达高于空白组和过表达组，Bax蛋白表达低于空白组和过表达组，具有统计学差异（P＜0.05）。过表达组Bcl-2蛋白表达低于空白组，Bax蛋白表达高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图2。

表3 各组卵巢癌细胞增殖、凋亡相关蛋白表达比较（±s）

表3 各组卵巢癌细胞增殖、凋亡相关蛋白表达比较（±s）

组别 Bcl-2空白组过表达组沉默组F P 0.38±0.12 0.29±0.09 0.99±0.26 12.068 0.001 Bax 0.55±0.15 0.60±0.19 0.44±0.12 3.377 0.001

图2 Bcl-2、Bax表达W B图

2.4 沉默RAGE对卵巢癌细胞周期的影响 沉默组G1期细胞率低于过表达组和空白组，空白组G1期细胞率低于过表达组，具有统计学差异（P＜0.05）。沉默组S期细胞率低于过表达组和空白组，空白组S期细胞率低于过表达组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。沉默组G2期细胞率高于过表达组和空白组，空白组G2期细胞率高于过表达组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 沉默RAGE对卵巢癌细胞周期的影响（%，±s）

表4 沉默RAGE对卵巢癌细胞周期的影响（%，±s）

组别 G1空白组过表达组沉默组S F P 73.35±20.26 76.62±12.25 68.16±8.15 2.727 0.003 14.48±3.15 20.82±6.15 10.11±3.02 7.415 0.001 G2 10.26±3.13 7.75±2.14 17.72±5.16 8.466 0.001

2.5 沉默RAGE对卵巢癌细胞周卵巢癌细胞周期相关蛋白表达 沉默组CDK4蛋白表达高于空白组和过表达组,Cyclin D1蛋白表达低于空白组和过表达组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。过表达组CDK4蛋白表达低于空白组，Cyclin D1蛋白表达高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表5、图3。

3 讨论

晚期卵巢癌患者的5年生存率不足30%[5]，梁伟晨[6]研究指出,寻找有效的抑制作用因子，为研究卵巢癌发生、转移具有重要作用，能提高患者生存率。RAGE是免疫球蛋白家族中重要成员,是多配体跨膜信号转导受体,与细胞表面不同配体结合发挥重要作用,在血管内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等细胞表面广泛存在[7,8]。苏才丽[9]研究指出,RA GE在肿瘤组织中表达异常,参与肿瘤的发生和发展，通过阻断RAGE能有效的抑制肿瘤的生长、转移。

表5 各组卵巢癌细胞周期相关蛋白表达比较（±s）

表5 各组卵巢癌细胞周期相关蛋白表达比较（±s）

组别 CDK4空白组过表达组沉默组F P 1.51±0.36 0.75±0.14 1.82±0.54 9.098 0.001 Cyclin D1 0.62±0.10 0.78±0.16 0.51±0.09 6.976 0.001

图3 CDK4、Cyclin D1表达W B图

RAGE在正常细胞中也有表达,发挥重要功能。齐红[10]研究指出，RAGE主要存在于患者卵巢表面上皮以及次级卵泡膜细胞中，有轻度表达。也有研究认为，在间质细胞、初级以及次级卵母细胞中RAGE显示中度表达，在成熟卵巢颗粒细胞中，RAGE显示强阳性表达[11,12]。RAGE在前列腺癌患者中发现RAGE基因过度表达,对前列腺癌细胞增殖和侵袭有促进作用[13]。RAGE在正常胃组织中显示为低表达，在胃癌患者中显示高表达，并且与其侵袭、转移有关[14]。因此通过沉默卵巢癌细胞中R AGE表达，能有效的抑制癌细胞增殖，对临床治疗卵巢癌具有重要意义。本文研究显示,沉默组24h、48h、72h细胞增殖率逐渐降低，并且低于空白组和过表达组各时间段的细胞增殖率，说明沉默RAGE表达，能抑制卵巢癌细胞增殖。

本文研究结果指出,沉默组24h、48h、72h细胞凋亡率逐渐升高,并且高于空白组和过表达组各时间段的细胞凋亡率。说明沉默RAGE能促进卵巢癌细胞凋亡。相关研究指出，RAGE基因能将细胞周期蛋白Cyclin D1激活,从而促进细胞增殖,RA GE基因对Akt磷酸化有显著的促进作用，并且能促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，在细胞增殖、凋亡中发挥重要的参与作用[15,16]。研究认为RAGE基因能通过激活Cyclin D1、自噬相关蛋白等，从而抑制癌症细胞凋亡,对肿瘤细胞存活率有提高作用[17]。Bcl-2参与细胞增殖也参与细胞凋亡。本文研究结果显示，沉默组Bcl-2蛋白表达较高，Bax蛋白表达降低，说明沉默RAGE能调控Bcl-2、Bax蛋白表达，从而抑制卵巢癌细胞增殖，促进其凋亡。

细胞周期能有效的调节信号通路传导异常,参与卵巢癌的发生和发展。G2/M检验点是细胞周期中重要的细胞检测点,在细胞一分为二过程中发挥着重要调控作用,细胞在进入有丝分裂前G2/M检验点能有效的修复DNA损伤[18,19]。本文研究证实,沉默组G1期和S期细胞率较低，G2期细胞率显著升高,说明G2到M期的转化过程受到导致抑制。过表达组和空白组S期和G2期相反，说明细胞周期失衡。细胞周期受多种因素的影响，CDK4属于细胞周期调节蛋白,具有重要调节作用，与CyclinD1结合有助于复合物活化，促进细胞从G1期向S期转化[20]。CDK4细胞周期一旦出现调控异常，会导致肿瘤发生，得到广泛关注。本文研究指出，沉默组CDK4蛋白表达显著升高，Cyclin D1蛋白表达降低，说明沉默RAGE能调控CDK4、Cyclin D1蛋白表达，调控细胞周期转化。目前卵巢癌患者一旦确诊已经处于中晚期,手术联合化疗虽然取得了一定的治疗效果，但是患者5年的存活率较低，患者容易出现耐药和转移,研究卵巢癌细胞的发病机制,为卵巢癌的靶向治疗提供理论依据，目前关于RAGE在卵巢癌细胞发病中作用的研究较少。

综上所述,沉默RAGE通过调控Bcl-2、Bax、CDK4、Cyclin D1相关蛋白表达，能抑制卵巢癌细胞增殖，促进其凋亡，阻碍G2至M期转化，为临床治疗卵巢癌寻找有效的靶向治疗途径。