采用花粉管通道法遗传转化月季石榴的研究

唐丽颖,陈利娜,敬 丹,骆 翔,李好先,曹尚银

(中国农业科学院 郑州果树研究所,河南 郑州 450009)

石榴(PunicagranatumL.),其原产地为俄罗斯、伊朗、土耳其、阿富汗和高加索等中亚、西亚地区,目前在全世界范围内广泛种植[1]。石榴在我国有2000多年的栽培历史,有“天下之奇树,九洲之名果”的美称[2]。长久以来,石榴因用途广泛、形态美观而受到人们的喜爱,其集食用、药用、经济、观赏、生态价值于一身,在我国被视为重要的经济林树种。目前我国除极寒冷地区外均有石榴分布,逐渐形成了几大石榴产区。近些年,石榴栽培的经济效益显著,已经成为许多地区脱贫致富奔小康的特色产业。截至2013年,我国石榴栽培面积约12万hm2,年产量120万t[3]。2017年,国内石榴总产量达169.71万t,石榴产品的需求量有167.90万t,同比增长13.1%[4]。

因石榴起源于中亚、西亚地区,喜温畏寒,适宜栽植于气候温暖的地区,就我国而言,淮河以北的石榴栽培区易发生冻害。石榴可以耐-16 ℃以上的低温,在-17 ℃下会发生冻害,在-20 ℃下会死亡。栽植广泛的‘突尼斯软籽’石榴在-10 ℃低温环境中超过12 h就会被冻伤[5]。2002年,山东省济宁市任城区长沟镇二年生5.3 hm2石榴冻死株率达70%以上[6];同年,陕西临潼地区绝对低温为-12.9 ℃,石榴树普遍发生了冻害[7]；2002年，山东东明降雪及持续低温6 d,最低气温达-13 ℃,400 hm2石榴受冻率达100%[8];2009年,安徽淮北发生“倒春寒”，导致约6667 hm2的栽培石榴受冻率达90%以上[9]；2009年，河南荥阳遭遇寒潮侵袭,‘突尼斯软籽’石榴约90%被冻死[10];山东枣庄石榴产区于2010～2015年间几次遭受冻害,其中2012～2013年冻害发生率为37.2%,2015年有70%～80%的石榴受冻害而死[12]。如此严重的冻害,常使产生经济效益的石榴树被冻死,给果农造成了极大的经济损失,严重打击了果农种植石榴的热情与信心。石榴冻害已经严重制约了我国石榴生产、育种、研究等相关工作的开展,阻碍了石榴产业在我国的发展,培育抗冻软籽石榴新品种可以为我国石榴产业发展提供新的思路及方向。

石榴品种选育的方法主要包括引种、实生选种、芽变选种、杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种、倍性育种、转基因育种[3]。目前,杂交育种仍是果树育种中应用较为广泛且有效的途径,按照常规杂交育种的方式,将遗传基础不同的品种进行人工授粉受精,再经过6～8代的回交和繁琐的背景选择,最终从后代中选择出具有优良性状的新品种,对于果树来说育种周期较长,育种效率较低。因此转基因育种已经逐渐成为新品种培育的重要手段。许多植物利用转基因技术育种获得了显著效果,例如：利用转录后基因沉默的现象,将番木瓜最主要的病毒病——环斑病的复制酶基因转入番木瓜基因组中,培育成抗环斑病的转基因番木瓜新品种“华农一号”[13];利用转基因技术提高了大豆的耐旱、耐盐、耐热性等[14],进而提高了大豆的品质与产量;用转基因技术培育出了抗旱抗病抗虫的棉花新品种,其中抗虫棉的培育与普及不仅减轻了棉铃虫的危害,还给农民带来了直接收入[15]。常见的植物转基因技术主要包括农杆菌介导转化法[16]、基因枪法[17]、花粉管通道法[18]、显微注射法[19]、电激法[20]等。目前较为常用的方法是农杆菌介导转化法和花粉管通道法。农杆菌Ti质粒基因转化法被广泛应用于双子叶植物中,截至2014年,有80%以上的转基因植株是利用根癌农杆菌转化系统产生的[21]。通过对根癌农杆菌Ti质粒基因转化法进行改进,使其用于果树育种,适用性广,木本植物也能通过此方法获得转化的植物细胞。发根农杆菌介导的植物转化法被广泛应用于生根困难的植物中,例如武姣等以山定子组培苗植株为试验材料,用发根农杆菌诱导产生发根,并由新发根获得了再生植株[22]。

我国科学家周光宇于1983年首次提出了花粉管通道法[23]。此后人们对花粉管通道法进行了大量的研究,包括外源基因转化机理、转化技术、转化后代的性状鉴定等,这项技术也逐渐被应用到育种工作中。近些年来,花粉管通道法已经成功地被应用于棉花、玉米、水稻、大豆等作物的育种工作中，例如：利用花粉管通道法将合成的Bt基因导入棉花优良品种,获得了转基因植株,形成了抗虫棉群体[24];王罡等利用花粉管通道法将Bt毒蛋白基因转入玉米自交系,为抗虫育种提供了优良抗源[25];王才林等采用花粉管通道法,将bar基因导入水稻,在142个后代植株中获得了4个转bar基因植株,在T3代形成了抗除草剂的稳定株系[26];将外源半野生大豆的总DNA经花粉管通道法直接导入栽培大豆,育成了高产、优质的大豆新品种黑生101[27]。

农杆菌介导法是目前果树转基因育种中应用较广泛的方法,也是石榴转基因育种中普遍使用的手段。Terakami等以矮化石榴叶片和茎段为外植体进行农杆菌介导的遗传转化,将NPTⅡ新霉素磷酸转移酶基因及绿色荧光蛋白基因GFP导入了石榴基因组[28]。郭晓丽以突尼斯软籽石榴的愈伤组织作为外植体,用农杆菌介导法转化抗寒基因,得到了转化植株[29]。Verma等用农杆菌介导法转化抗虫基因[Cry1A(b)]和NPTⅡ,成功获得了转化植株[30]。农杆菌介导技术发展至今,虽取得了一定的进展,但仍存在遗传转化体系不完善、转化效率低等问题[31]。

我们将花粉管通道法与农杆菌介导法结合,将月季石榴的花柱浸泡在含有PgLCBF1目的基因的农杆菌菌液中,利用该植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道将外源基因导入受精卵细胞,并进一步整合到受体细胞的基因组中,最后随着受精卵的发育而获得了含有抗寒基因PgLCBF1的抗寒石榴新品种。本研究的目的是为育种周期较短、效率较高的石榴转基因育种方法的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 供试材料为中国农业科学院郑州果树研究所干果课题组试验基地中当年开花的月季石榴实生苗,采用常规栽培管理方法进行管理。选择连接pBI121载体的PgLCBF1基因对月季石榴进行遗传转化。

1.1.2 菌株和质粒 感受态细胞Trans-T1；农杆菌菌株GV3101;试验所用的PgLCBF1基因质粒由本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 观察花粉管的萌发情况

1.2.1.1 采集花粉 摘取花粉成熟的钟状花,去掉花瓣,待其自然阴干后,将两花相对进行摩擦,收集落下的花粉。

1.2.1.2 授粉 用铅笔的橡皮头蘸取收集好的花粉,轻轻点涂在筒状花花柱的柱头上。

1.2.1.3 观察花粉管的萌发 分别于授粉后24、32和48 h取花柱,先用FAA固定液固定24 h以上,再用2 mol/L的NaOH溶液在65 ℃恒温箱中软化处理7 h,待样品为半透明状后用清水冲洗,最后用0.1%水溶性苯胺蓝溶液染色过夜[17]。使用OlympusDP71荧光显微镜观察花柱中花粉管的萌发情况。

1.2.2 用热激法转化Trans-T1感受态细胞 取pBI121质粒5 μL，将其加入到50 μL处于冰水混合状态的Trans-T1感受态细胞中,轻弹混匀,置于冰上30 min；42 ℃水浴热激30 s,立即置于冰上2 min；加入250 μL液体LB无抗培养基,在200 r/min、37 ℃下培养1 h；取100 μL菌液，涂在含50 mg/L Kan的固体LB培养基上,37 ℃培养过夜。

1.2.3 表达载体PgLCBF1-pBI121的构建 挑取过夜培养的pBI121单菌落于含Kan的液体LB培养基中,在230 r/min、37 ℃条件下培养12 h，然后用质粒提取试剂盒(TIANGEN)提取菌液质粒；对质粒进行XbaⅠ酶切，酶切反应体系见表1；酶切完成后,用胶回收试剂盒回收酶切片段；将PgLCBF1目的片段连接到表达载体pBI121上,连接程序为25 ℃ 10 min；取连接反应体系(见表2)250 μL，涂在含Kan的固体培养基上,37 ℃培养过夜；挑取单菌落进行PCR，检测目的片段与表达载体是否连接成功；在连接完成后转化Trans-T1感受态细胞。

表1 酶切反应体系

表2 目的片段和表达载体连接反应体系

1.2.4 菌液的制备 把带有PgLCBF1目的基因的农杆菌接种在YEP固体培养基(YEP+Kan 50 mg/L+Rif 25 mg/L)上，培养24～48 h；挑取单克隆,转接到1 mL液体培养基(YEP+Kan 50 mg/L+Rif 25 mg/L)中,在230 r/min、28 ℃下培养24 h；利用菌液PCR方法鉴定出阳性单菌落后，按照1∶100的比例继续在YEP+Kan 50 mg/L+Rif 25 mg/L液体培养基中扩大培养,在230 r/min、28 ℃下培养12 h左右,使OD600处于0.8～1.2的最佳范围。将获得的农杆菌菌液以4000 r/min在4 ℃下离心10 min,收集菌体,然后用重悬液将菌体重悬至OD600为0.8左右,置于冰上备用。重悬液配方为: MS+蔗糖5%+Silwet L-77 0.03%(体积分数)或蔗糖5%+Silwet L-77 0.03%(体积分数)。

1.2.5 浸染转化 根据花粉管生长的荧光显微观察结果确定合适的转化时机。选择试验树上柱头未开裂的筒状花,将重悬好的农杆菌菌液倒入塑料盒中,浸没筒状花2 min；在花柄处涂抹赤霉素10 mg/L,套袋保湿24 h，并挂牌标记。浸染时针对浸染介质及授粉方式设计了4个不同的处理,如表3所示。采用花粉管通道法进行月季石榴遗传转化的流程见图1。

表3 花粉管通道法设置的不同处理

1.2.6 转基因植株的催芽播种 将获得的石榴种子于4 ℃处理15～30 d；用清水搓洗表面果肉；用1 mol/L HCl浸泡15 min；用清水清洗5～6遍；用清水浸泡7 d左右,1～2 d换水1次,洗净残留果肉。

A为月季石榴当年开花；B为浸染花状态；C为浸染后套袋保湿24 h；D为催芽后播种；E为获得实生苗。

1.2.7 转化植株的检测 将获得的实生苗以每100棵为一组混样,进行GUS染色；将叶片浸没染色液后使用真空泵抽气至真空状态并保持2 h,于37 ℃孵育12～24 h；最后用75%乙醇脱色后进行观察,筛选出叶片显蓝色的组合。将筛选出的每个组合进行逐棵取样,剪取转基因植株茎尖附近1～2片嫩叶,采用磁珠法提取基因组总DNA。使用35s通用引物为上游引物,根据目的基因序列设计合成下游引物CBF1-R:5’-CTACCAAGTGGAGTGATTCCATA-3’。采用Vazyme高保真聚合酶2×Phanta Max Master Mix进行PCR扩增，PCR扩增体系见表4，扩增程序:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃ 5 min;在4 ℃下暂存。将扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,然后进行凝胶回收纯化(TIANGEN,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)。对凝胶回收产物进行测序验证,测序委托河南尚亚生物技术有限公司完成。

表4 PCR扩增体系

2 结果与分析

2.1 花粉管萌发情况

观察发现,授粉后24 h花粉开始萌发,但并未伸长生长(图2A)；授粉32 h和48 h时花粉管已伸到子房(图2B、图2C),因此推测选择授粉后24 h进行菌液浸染可能使菌液深入到花粉管,进而提高转化效率。

A：授粉后24 h花粉开始萌发,未到达子房。B：授粉后32 h花粉萌发,开始伸长。C：授粉后48 h花粉伸长至子房。

2.2 不同处理对转化后石榴坐果率、出芽率、阳性率的影响

2.2.1 不同处理获得的果实数、种子数及出芽数 在本试验中,每处理浸染5朵花。由表5可知：处理Ⅰ收获5个果实、811粒种子，其中338粒发芽,获得了2株阳性植株,阳性率为0.25%;处理Ⅱ收获5个果实、565粒种子，其中380粒发芽,获得了10株阳性植株,阳性率为1.77%;处理Ⅲ收获3个果实、520粒种子,其中346粒发芽,获得了2株阳性植株,阳性率为0.38%;处理Ⅳ未收到果实。

表5 不同处理对转化后石榴坐果率、出芽率、阳性率的影响

2.2.2 不同处理对坐果率的影响 从表6可以看出：当浸染介质为MS+5%蔗糖时,处理Ⅰ的坐果率为100%,处理Ⅲ的坐果率为60%;当浸染介质为5%蔗糖时,处理Ⅱ的坐果率为100%,处理Ⅳ未收到果实,说明在授粉后24 h浸染有助于提高坐果率，而浸染介质对坐果率的影响不大。

表6 不同处理的坐果率比较 %

2.2.3 不同处理对出芽率的影响 由表7可见：当浸染介质为MS+5%蔗糖时,处理Ⅰ的出芽率为41.68%,处理Ⅲ的出芽率为66.54%;当浸染介质为5%蔗糖时,处理Ⅱ的出芽率为67,26%,处理Ⅳ未收到果实，说明在浸染介质MS+5%蔗糖下,宜采用浸染时授粉方式，而在浸染介质5%蔗糖下,宜采用授粉后浸染方式。

表7 不同处理的出芽率比较 %

2.2.4 不同处理对阳性率的影响 如表8所示：当浸染介质为MS+5%蔗糖时,处理Ⅰ的阳性率为0.25%,处理Ⅲ的阳性率为0.38%,相差0.13个百分点;当浸染介质为5%蔗糖时,处理Ⅱ的阳性率为1.77%,说明授粉方式对阳性率影响不大，但采用浸染介质5%蔗糖有利于提高阳性率。

2.3 GUS染色及阳性植株的PCR检测结果

对1819棵植株进行GUS染色,获得了82棵显蓝色的待检测植株。对这些待检测植株进行逐棵取样,提取DNA后进行PCR检测,3次重复验证,得到了14个可以扩增出目的基因的样品(图3～图4),初步证明PgLCBF1基因已被整合到月季石榴的基因组中,获得14棵转基因月季石榴植株。进一步的表型观察、抗性分析及遗传稳定性等分析验证工作正在进行中。

表8 不同处理的阳性率比较 %

3 讨论与结论

迄今，石榴转基因育种主要采用农杆菌介导法,存在转化体系不完善、转化效率低、再生率不高等问题。Terakami等利用农杆菌介导法成功地将目的基因转入石榴基因组,证明农杆菌的感染能力与基因型、外植体类型有关,不同基因型、类型的外植体在相同条件下遗传转化时转化率存在明显差异[28]；连红可初步建立了‘突尼斯软籽’石榴的瞬时表达体系[32]；李跃霞的研究表明Kan和Glu的质量浓度对愈伤组织的形成影响较大,Cef的质量浓度对材料上杂菌的生长有不同程度的影响[8]。吴亚君经研究得出,用石榴组培苗的子叶为外植体进行遗传转化,在共培养3 d后未发生褐化,并且能诱导出抗性芽[33]。Verma等以石榴品种‘Kandhari Kabuli’的胚、子叶和茎段为外植体成功进行了遗传转化[30]。赵玉洁分别以石榴组培苗的子叶、叶片、上胚轴和下胚轴为外植体,进行了遗传转化试验[34]。Verma等在进行农杆菌介导石榴转化时虽成功获得了转化植株,但是转化率仅为23.0%左右[30];郭晓丽[29]、吴亚君[33]及赵玉洁[34]在研究中虽然得到了抗性芽,但均未出现转化苗生根的现象;杨选文等对石榴的遗传转化受体材料进行研究,筛选不同激素种类和浓度的初代培养基,经过多次继代培养,筛选出稳定且无菌的石榴增殖培养基,得到了稳定健壮的叶片受体材料[35]。

M:DL2000 Marker。S1～S14:待测样品(714 bp)。0:阴性对照。1:阳性对照(714 bp)。

图4 胶回收产物测序结果与PgLCBF1序列对比

我国的科学家周光宇提出了花粉管通道法[36],采用该方法导入的DNA片段或目的基因易于整合,使目的基因所控制的性状在受体植株中易于稳定[37]。花粉管通道法被认为是一种直接、简单、有效的转基因技术,有较广阔的应用前景。目前花粉管通道法并不成熟,在植物中应用还不广泛。花粉管通道法在小麦转基因中的效率一般为0.2%～8.0%,也有人得到了30%的转基因效率,但仍存在结实率与转化率差异大、后代存在变异株系等问题[38]。王树军等首次将花粉管通道法应用于荔枝转基因育种中,但转化效果不理想[18]。许多研究表明,DNA导入时间及处理部位对结实率及转化率都有影响，其中DNA导入时间较为重要,因为经花粉管进入胚囊的外源DNA能否成功参与受精是花粉管通道法转化成功与否的关键。此外,温度、湿度等因素也会影响花粉管通道法的转化结果[38]。

本研究将花粉管通道法与农杆菌介导法结合起来，应用于月季石榴的遗传转化,利用自身的生殖系统作为载体,在遗传转化技术方面避免了繁琐的组织培养与再生过程,直接通过花粉管通道转化目的基因,并经PCR检测,初步证明获得了14棵转基因阳性植株,这为拓展石榴遗传转化的途径提供了新思路。同时,对花粉管的萌发情况进行观察,确定在授粉后24 h进行转化较为合适。针对4个不同处理,综合比较坐果率、出芽率、阳性率等,发现“浸染介质为5%蔗糖,授粉方式为授粉后24 h浸染”的效果较好,这为后续研究、优化奠定了基础。但该方法的转化效率不理想,可能存在后代分离现象。我们以后拟进一步对所获得的转基因月季石榴阳性植株进行表型观察、抗性分析，并在本试验的基础上不断优化遗传转化体系,对不同的影响因素进行深入研究,以期建立简单、高效、稳定的石榴花粉管通道法遗传转化技术体系。