枣果实糖组分含量动态变化与相关基因表达分析

张亚若,童盼盼,梁丰志,吴翠云,3,王江波,3*

(1.塔里木大学 植物科学学院,新疆 阿拉尔 843300;2.塔里木大学 南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室,新疆 阿拉尔 843300;3.新疆生产建设兵团 塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆 阿拉尔 843300)

枣(ZiziphusjujubeMill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(ZiziphusMill)植物[1]。枣树是我国第一大干果树种,具有很强的适应性,在平川、山地、丘陵均能种植,在我国的栽培大致分布在北纬23.0°～42.5°与东经76°～124°区间内,除吉林、黑龙江、西藏、青海外,其他地区均有栽培[2]。得天独厚的水土光热气候等自然资源,造就了新疆红枣卓越的品质,新疆的红枣产量超过全国的1/4[3],已经成为新兴枣产区。新疆红枣价格最高时达到50～60元/kg;受红枣价格暴涨的影响,枣农迫切追求产量效益,忽视果品品质,造成了红枣产业的不健康发展[4]。优化果实糖酸比、提升品质是提高红枣生产效益和经济效益的关键因素,也成为近年来学者们关注的重点。在果实发育过程中,糖含量和糖代谢相关酶活性的变化特点及相互间的关系已较为明确[5-9]。随着分子生物技术的发展,国内外有关苹果、梨[11-12]、桃[13]、柑橘[14]的分子生物学研究已十分广泛,例如：杨静静[10]利用农杆菌介导法转化‘嘎啦’苹果,经分子和酶活性鉴定,获得了3个MdFRK2基因过表达的阳性转基因植株;李馨玥等[12]分析了不同基因在‘南果梨’果实发育过程中的表达变化,以及在蔗糖转运以及糖的积累和代谢过程中的功能;张春华等[13]利用荧光定量PCR测定了6个蔗糖合成酶基因的表达水平,结果表明PpSus3在果实和韧皮部，以及PpSus1在叶片中对糖类代谢可能具有更重要的作用。然而在枣上的研究始终落后于其他大宗果树。我们选取新疆南疆地区的主栽红枣品种为试验材料,通过高效液相色谱法和实时荧光定量PCR法对枣果实发育过程中糖组分含量的变化以及糖代谢关键基因的表达趋势进行了研究,以期从分子生物学角度明确枣果实的糖代谢及其调控机理,为今后枣树的分子育种和遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

供试红枣材料采自塔里木大学枣种植资源圃,该资源圃地处北纬40°32′、东经81°17′,属暖温带大陆干旱荒漠气候区,年均气温≥10 ℃,年积温为4113 ℃·d,无霜期220 d,年均日照时数2900 h,年均降水量为40.1～82.5 mm;土壤为轻盐化土。

1.2 供试材料

试验材料选自资源圃保存的骏枣、灰枣与冬枣品种(图1)。选择树体生长水平良好、树势一致的单株各3株作为样本树。自枣果实发育膨大期(8月13日)至完熟期(10月2日),每隔10 d,采取果实样本1次。采果时从每株树的不同方向选取大小一致的30个枣果,放入采样盒中，立即带回实验室,洗净后去核切碎,同时分成两等份,经液氮速冻后,放于-80 ℃冰箱中保存,分别用于糖组分含量、相关基因表达的测定。

图1 骏枣、灰枣和冬枣在不同时期的果实

1.3 试验方法

1.3.1 糖组分含量的测定 采用高效液相色谱法[15]进行测定。样品制备:精确称取1.0000 g枣样,充分研磨后加入10 mL的80%乙醇混匀,于80 ℃水浴加热30 min,待冷凉至室温后以4000 r/min转速离心10 min；然后取上清液,残渣继续用80 ℃的乙醇重复提取；合并滤液,旋转蒸发除去其中乙醇,用超纯水定容至25 mL容量瓶中,过0.45 μm微孔滤膜,待测。高效液相色谱仪1260由美国Agilent公司生产。液相色谱条件:色谱柱Waters XBridgeTM Amide (250 mm×4.6 mm,5 μm)；将溶液A[0.2%三乙胺(TEA)的超纯水溶液]和溶液B (0.2%TEA和乙腈)按照24∶76的体积比混合作为流动相；柱温为30 ℃;雾化管温度为60 ℃；漂移管温度为60 ℃；气流量为1.6 L/min；增益值为1.0。标准曲线建立:将糖混合标准溶液用超纯水逐级稀释，配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL等6个不同浓度的标准液,过0.45 μm微孔滤膜,依次进样10 μL,以糖浓度(X)作为横坐标,峰面积(Y)作为纵坐标,制作标准曲线,建立回归方程(表1),相关系数为0.9986～0.9997。

表1 糖组分测定的回归方程及其相关系数

1.3.2 Q-PCR分析糖代谢相关基因的表达 采用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的B518661柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒,按说明书对骏枣、灰枣和冬枣发育过程中果实的RNA进行提取。使用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的R312-01/02试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)进行反转录得到cDNA。以UBQ作为内参基因[16],表2 为内参基因和目的基因的引物序列,由生工生物公司合成特异性引物。以合成的cDNA为模板进行PCR反应,反应体系10 μL：cDNA模板0.5 μL、左右引物各0.2 μL、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 5 μL、ddH2O 4.1 μL。在QuantStudioTM5 System荧光定量PCR仪上进行荧光定量表达分析,采用2-ΔΔCT方法进行数据分析。

表2 qRT-PCR的引物序列

1.4 统计分析

应用Excel 2010和DPS 7.55软件对试验数据进行统计整理和方差分析；采用QuantStudio Design & Analysis Software软件对相关基因的表达量进行分析。

2 结果与分析

2.1 枣果实发育过程中糖组分含量的变化

图2显示了骏枣、灰枣和冬枣果实在发育过程中糖组分含量的变化。在这3个主栽品种中,蔗糖含量的变化均表现为前期低、后期高。在8月13日和8月23日,蔗糖含量明显低于果糖和葡萄糖含量；自9月2日起，蔗糖含量均高于果糖和葡萄糖含量,且随着果实的成熟而逐渐上升,在每隔10 d的含量之间都存在极显著性差异,到10月2日时,骏枣、灰枣、冬枣的蔗糖含量分别达到490.96、507.28、443.06 mg/g。在枣果实的发育过程中,果糖和葡萄糖的含量始终保持在较为接近的水平,但不同品种的变化趋势不尽相同。骏枣果实在发育过程中,果糖和葡萄糖的含量在9月22日最高,分别为102.91和100.29 mg/g。在灰枣中,果糖和葡萄糖的含量在10月2日最高,分别达到107.28和109.18 mg/g。冬枣中的葡萄糖和果糖含量在9月2日最高,分别为57.80和51.53 mg/g。

2.2 枣果实发育过程中糖代谢相关基因表达水平的变化

对枣果实中12个糖代谢相关基因的表达量进行检测,包括5个蔗糖合成关键基因(ZjSPS1～2、ZjSS1～3)、2个转化酶类基因(ZjvINV1～2)、2个己糖基因(ZjHK3、ZjHK6)、3个糖转运蛋白基因(SUC2～3、SWEET2)。以各品种果实中各基因在8月13日的表达水平为参照做相对分析。

图3显示的是蔗糖合成关键基因(ZjSPS1、ZjSPSP2、ZjSS1、ZjSS2、ZjSS3)在骏枣、灰枣及冬枣的果实发育过程中表达量的变化。ZjSPS1和ZjSS2在3个主栽品种果实发育过程中表达量的变化趋势大致相同,都在9月12日最高,之后下降,在10月2日又有所上升。ZjSPSP2、ZjSS1、ZjSS3的表达量在不同品种中呈现不同的变化趋势。在骏枣果实的发育过程中,9月2日ZjSPSP2、ZjSS1、ZjSS3的表达量极低；9月22日ZjSPSP2的表达量极低,ZjSS3的表达量达到最高；ZjSPSP2和ZjSS1的表达量在10月2日达到最高。ZjSS1在灰枣果实发育过程中的表达量始终较低,在9月2日最高；ZjSPSP2和ZjSS3在灰枣中的表达量在9月12日达到最高,之后逐渐降低。在冬枣中,ZjSPSP2在9月12日的表达量最高,在10月2日次之;ZjSS1在9月22日的表达量最高,在8月23日次之;ZjSS3的表达量始终处在较低水平,以10月2日最低。

图2 骏枣、灰枣和冬枣果实中糖组分含量的变化

图3 枣果实发育过程中ZjSPS1、ZjSPS2、ZjSS1、ZjSS2、ZjSS3基因的表达量

如图4所示,转化酶基因(ZjvINV1、ZjvINV2)在3个主栽品种的果实发育初期(8月13日)表达量较高,在其他日期的表达量大都显著低于8月13日的表达量,仅骏枣果实中ZjvINV1在9月2日的表达量略高于8月13日的。己糖激酶基因(ZjHK3、ZjHK6)的表达量在3个主栽品种果实发育期间都表现为前期上升,后期下降之后再上升,其中骏枣和冬枣果实中ZjHK3和ZjHK6在不同时期的表达量差异波动明显,而灰枣果实中ZjHK3和ZjHK6的表达量在一个较为接近的水平中变化。

从图4还可以看出,本试验检测的糖转运蛋白基因(ZjSUC2、ZjSUC3、ZjSWEET2)的表达量在不同品种中呈现出各不相同的变化趋势。ZjSUC2在骏枣果实中9月22日至10月2日期间表达量显著升高,在灰枣果实中9月2日至9月12日期间上升最为明显,在冬枣果实中8月13日至8月23日期间出现明显上升,后期大致稳定。骏枣和灰枣中ZjSUC3的表达量均在9月12日最高,在9月22日最低;冬枣中ZjSUC3的表达量在8月23日最高,在中期趋于稳定,在10月2日最低。ZjSWEET2在骏枣整个发育期间的表达量都极低,在灰枣和冬枣果实发育前期的表达水平低,在9月22日几乎不表达,但在9月22日至10月2日期间的表达量上升,在10月2日的表达量达到最高。

图4 枣果实发育过程中ZjvINV1、ZjvINV2、ZjHK3、ZjHK6、SUC2、SUC3、SWEET2基因的表达量

2.3 糖组分含量与相关基因表达量间的相关性分析

图5是3个主栽品种枣果实的糖组分含量与糖代谢相关基因的表达量做相关性分析的热图结果。果糖含量、葡萄糖含量与ZjSPS1的表达量呈极显著正相关,与ZjSS3的表达量呈显著正相关,与ZjHK3的表达量呈显著负相关;果糖含量还与ZjSUC2的表达量呈显著正相关。蔗糖含量与ZjSPS1的表达量呈显著正相关,与ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的表达量呈显著负相关。

“+”和“-”分别表示正相关和负相关；“*”和“**”分别表示显著相关(P<0.05)和极显著相关(P<0.01)。

3 讨论与结论

枣果实在发育时,碳水化合物输入果实后,仅少量以淀粉的形式积累,大部分以可溶性糖的形式贮存于果实中,是典型的糖积累型果实[17]。根据成熟时糖组分的比例,可以将糖积累型果实又分为还原糖积累型、中间型、蔗糖积累型3种类型[18]。大多数研究学者已明确骏枣、灰枣和冬枣皆属于蔗糖积累型果实[19-20]。在本试验中，骏枣、灰枣和冬枣果实在发育前期以还原糖积累为主,在后期蔗糖含量逐渐上升,还原糖含量略微下降,至果实成熟时,蔗糖含量显著高于还原糖含量,符合蔗糖积累型果实糖组分含量的变化规律。糖代谢关键酶主要包括蔗糖合成酶类:蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖合酶(SS),转化酶类(INV)及单糖降解酶类(己糖激酶)[21]。蒋爽等[22]的研究结果表明,SPS1和SPS2在梨果实糖合成中起关键作用。本试验结果表明,在骏枣果实发育过程中,ZjSPS1和ZjSS2在果实发育后期呈现特异高表达趋势,说明ZjSPS1和ZjSS2在骏枣果实蔗糖积累过程中的调控作用较强;SWEET2在8月13日之后的表达水平始终明显低于8月13日的，这可能是果实中其他糖组分含量低的重要原因。在灰枣中,ZjSPS1自8月23日起的表达量极显著高于8月13日的,表明ZjSPS1是灰枣果实蔗糖积累过程中的主要调控基因;ZjSS2在9月12日时特异高表达,9月12日灰枣果实中的蔗糖含量开始显著高于还原糖含量,ZjSS2可能在这其中起到关键作用;ZjHK6的表达量呈前期上升、后期下降的趋势。张春梅[16]认为ZjHK3和ZjHK6可将葡萄糖转化为6-磷酸-葡萄糖,进而分解为磷酸烯醇丙酮酸,为酸代谢提供底物;还有学者发现ZjSUC在枣果可溶性糖积累尤其是在蔗糖积累过程中发挥了重要的作用[23]。本试验发现，ZjSUC2在灰枣各时期的表达量均高于8月13日的,且在其表达量明显上升时蔗糖含量也显著升高,因此推测ZjSUC2在灰枣果实蔗糖积累中起重要作用。在冬枣中,ZjSPS1和ZjSPS2表达量的变化趋势基本一致,均为前期低、后期高;ZjSS1在冬枣果实发育初期的表达量即出现显著性上升,而ZjSS2在果实发育后期出现特异性高表达,说明ZjSPS1、ZjSPS2、ZjSS1和ZjSS2共同调控冬枣的蔗糖积累过程,且ZjSS2可能具有较强的调控能力;ZjSWEET2在冬枣成熟期表达量显著上升,这可能是成熟期冬枣口感脆甜的主要原因。张春梅[16]对枣和酸枣的研究显示,ZjvINV1和ZjvINV2在酸枣中的表达量较高,而在枣中的表达量极低。本试验基因表达分析的结果显示,ZjvINV1和ZjvINV2在3个品种的果实发育期间几乎不表达,推测ZjvINV1和ZjvINV2在枣果实中的低表达是果实还原糖含量低于蔗糖含量的重要原因。果实糖组分含量的变化与各基因表达量变化的相关性分析结果表明：在枣果实发育过程中,ZjSPS1对蔗糖和还原糖的积累都具有一定的调控作用,与还原糖的积累相关性更强;ZjSS3和ZjSUC2的表达促进了枣果实中还原糖的积累；ZjHK3的表达在还原糖的积累中起抑制作用;ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的低表达在一定程度上促进了蔗糖的积累。

综上所述,本研究得出结论,在相同的糖积累类型品种中,枣果实糖组分含量在果实发育过程中的变化规律大致相同,但不同品种中各基因表达量的变化趋势存在一定的差异,其中ZjSPS1和ZjSS2在骏枣果实糖积累过程中起到重要调控作用;ZjSPS1、ZjSS2、ZjHK6、ZjSUC2在灰枣果实的蔗糖积累中起重要作用;ZjSPS1、ZjSPS2、ZjSS1和ZjSS2共同调控冬枣的蔗糖积累过程。本研究初步分析了不同基因在骏枣、灰枣及冬枣果实发育过程中的表达变化,但不同基因在枣果实蔗糖转运以及糖积累和代谢过程中的具体功能还需进一步研究。