ARL15基因多态性与延边地区2型糖尿病及糖尿病肾病的相关性

张洪江 王伟杰 邵薇 凃影叶 杜飞 杨康鹃

(1延边大学附属医院，吉林 延吉 133000；2珲春市中医院；3延边大学医学院)

糖尿病肾病(DN)是2型糖尿病(T2DM)最常见的微血管病变，我国T2DM患病人数居全球首位，DN的患病率也逐年上升。DN 发病机制也在广泛研究中，但具体发病机制尚不明确。目前普遍认为DN 的发病机制可能与遗传因素，如微小RNA(miRNA)〔1〕、DNA甲基化〔2〕、代谢紊乱〔脂联素(PA)、多元醇通路〔3〕、蛋白激酶C〔4～6〕等〕 、血流动力学改变、炎症反应〔7，8〕、氧化应激(活性氧类、内质网应激)〔9～12〕等因素有关。因此，通过研究DN的发病机制，了解疾病的发生、发展，对疾病的早期干预及预防都具有重大意义。

PA与DN关系密切，研究表明在终末期肾病患者中，无论原发病是否为T2DM，均可引起PA水平升高〔13～17〕。另外，有研究表明〔18〕，早期DN可能与和肽素、PA水平升高有关。Richards等〔13〕在2009年全基因组水平上进行的一项荟萃分析发现，ADP-核糖基化样因子(ARL15)基因rs4311394位点的突变等位基因G与T2DM相关，且G等位基因与低水平的血浆脂联素PA水平相关。Zhao等〔14〕发现胰岛素刺激可以上调ARL15表达；当ARL15过表达可以增强成C2C12 肌管中胰岛素信号通路关键分子胰岛素受体(IR)/胰岛素受体底物(IRS)1/蛋白激酶B(AKT)的磷酸化，从而调节胰岛素信号传导途径的磷酸化失调，抑制胰岛素抵抗；因此提出ARL15是胰岛素敏感的效应分子。另外有研究发现〔15〕ARL15是T2DM的危险因素，与总胆固醇(TC)、PA、胰岛素均具有相关性，ARL15通过增加AKT和AMPK下游代谢通路促使糖原、脂肪的合成。全基因组关联分析(GWAS)揭示了ARL15多态性与T2DM的关联，以微血管病变为特征的DN是否与ARL15多态性相关仍有待于进一步研究。目前国内外尚缺乏ARL15基因多态性与DN相关性的研究，本研究将通过病例对照关联分析对ARL15基因多态性位点rs35941、rs26770、rs4311394、rs645017与延边地区朝鲜族和汉族T2DM及DN人群进行相关性分析。通过连锁不平衡(LD)及单倍型分析，探讨ARL15基因多态性位点联合作用与ARL15、PA、胰岛素等相关性，另外分析ARL15与临床实验室指标、PA、胰岛素的相关性及对单纯T2DM、DN的累加效应，为T2DM及其并发症DN的预防和靶向治疗提供遗传学数据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2016～2019年在延边大学附属医院及珲春市中医院单位体检和就诊患者751例。设计对照研究，将研究对象分为3组：葡萄糖耐量正常对照组(NGT组268例)朝鲜族131例，汉族137例；单纯糖尿病组(T2DM组393例)朝鲜族188例，汉族205例；糖尿病肾病组(DN90例)朝鲜族35例，汉族55例，所有参与者对研究内容知情同意。诊断标准参考糖尿病诊断标准(1999年WHO标准)及2014年美国肾脏病基金会对肾脏疾病控制的临床实践指南(NKF-KDOQI)颁布的诊断标准。

1.2SNP位点的选取 通过NCBI SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)筛选ARL15基因SNP，其最小等位基因频率(MAF)在1 000 Genomes研究东亚人群中大于0.05。本研究纳入4个ARL15基因SNP：rs35941、rs26770、rs4311394、rs6450176。

1.3实验室指标检测与基因组DNA的提取 收集所有参与者性别、年龄、血压、体重指数(BMI)。清晨抽取空腹外周静脉血于2 ml置于促凝管中，3 000 r/min离心10 min并分离血清，采用实验室生化常规仪器检测空腹血糖(FPG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、TC、三酰甘油(TG)。采取0.5 ml全血于二氨基联苯胺(EDTA)-Na2抗凝管中，离心后将样本保存于-80℃环境，所有样本待同一时间提取基因组DNA。使用长春百奥生物技术有限公司AxyGene小量全血基因组DNA提取试剂盒，参照说明书提取全血DNA。

1.4引物的设计与合成 登录NCBI查询ARL15基因序列，利用Primer3软件辅助设计引物序列(表1)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5PCR-LDR基因分型 (1)在15 μl体系中进行多重PCR扩增反应，其中样品DNA 1～2 μl，2×PCR mix 7.5 μl，混合引物2 μl，双蒸水补至15 μl。多重PCR反应参数：94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，45个循环。(2)在7 μl体系中进行PCR纯化，其中PCR产物3 μl，ExoI 0.2 μl，FastAP 0.8 μl，ExoI缓冲液0.7 μl，双蒸水补至7 μl；反应参数：37℃ 15 min，80℃ 15 min。(3)延伸反应，其中PCR产物2 μl，Snapshot Mix试剂1 μl，延伸引物1 μl，双蒸水补至6 μl；反应参数：96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s，30个循环。

1.6统计学处理 运用SHEsis在线软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验、等位基因和基因型频率分析、LD分析及单倍型分析。等位基因和基因型频率分析使用χ2检验计算P值和风险值(OR)。通过LD分析，计算D'值和r2值。D'=0，r2=0时，表示完全连锁平衡；D'=1，r2=1时，表示完全连锁不平衡状态；|D'|≥0.8时表示存在强连锁不平衡。使用SPSS25.0软件进行t检验。

表1 SNP位点及引物

2 结 果

2.1ARL15基因分型结果 根据NGT组4个SNP rs35941、rs26770、rs4311394和rs6450176的基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，4个SNP的基因型频率在NTG组中符合遗传平衡(P>0.05)。见图1～4。

图1 ARL15基因rs26770G/G，A/G，A/A位点测序

图2 ARL15基因rs4311394C/C，C/T，T/T位点测序

图4 ARL15基因rs6450176A/A，A/G，G/G位点测序

2.2SNPs等位基因及基因型分布 4个SNP的等位基因和基因型频率在延边地区朝鲜族和汉族人群之间差异无统计学意义(P>0.05)。将每组中朝鲜族和汉族人群视为同一群体，在隐性遗传模型中，携带rs35941位点CC基因型频率在DN组显著高于T2DM组，增加T2DM患者发生DN的风险(P=0.026)，且CC基因型在DN组和NGT组也具有增加风险的趋势(P=0.057)，但rs35941等位基因频率在DN组与T2DM组、NGT组差异无统计学意义(P>0.05)。其他SNP的等位基因和基因型频率在DN组与T2DM组、NGT组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、图6。

R/RR：参考等位基因/野生纯合子；RA：突变杂合子；A/AA：突变等位基因/突变纯合子图5 NGT组汉族和朝鲜族ARL15基因SNPs等位基因和基因型频率

R，参考等位基因；A，突变等位基因；RR，野生纯合子；RA，突变杂合子；AA， 突变纯合子图6 ARL15等位基因、基因型分析

2.3LD、单倍型及联合基因型分析 rs431139与rs6450176之间存在较强连锁不平衡(D'=0.897,r2=0.780)，其他位点之间未发现有明显意义的连锁不平衡(D'或 r2<0.8)。由于rs431139与rs6450176的等位基因和基因型频率在3组之间不存在差异，故对4个SNP的单倍型进行分析。见图7。

位点间LD分析数值以D'-r2表示图7 SNP位点LD分析

ARL15基因4个SNP仅rs35941位点CC基因型在隐性遗传模型中显示与DN相关。考虑多基因遗传病具有微效基因累加效应特点，对单倍型和联合基因型与疾病进行关联分析。在单倍型分析中，仅对等位基因频率大于0.01的单倍型进行分析，结果显示，相对于NGT组和T2DM组，单倍型CCGA(rs35941-rs26770-rs4311394-rs6450176)与高风险DN相关(P<0.05)。相对于T2DM组，单倍型CTAG(rs35941-rs26770-rs4311394-rs6450176)与高风险DN相关(P<0.05)。见表2。

表2 单倍型、联合基因型及其实验室指标分析[n(%)]

随后，联合4个SNP的基因型，对该阳性单倍型的基因型进行分析，基因型频率下限为0.01。结果显示， CT-CT-AG-AG联合基因型频率在DN组中显著小于NGT组(P<0.005)，同时，该联合基因型频率具有降低T2DM发生DN风险的趋势。另外发现FPG和TG在T2DM组中显著高于NGT组；HDL-C在NGT组显著高于DN组，差异有统计学意义(P=0.005)。若将基因型频率下限选为0.1%，与NGT组相比，CC-CC-AG-AG联合基因型与降低T2DM风险相关(P<0.005)；相反，与T2DM组相比，CC-CC-AG-AG联合基因型与增加DN风险相关(P<0.05)。分析该联合基因型的实验室检测指标后，发现TG和PA水平在NGT组和DN组有显著差异。由于CC-CC-AG-AG联合基因型在T2DM组的基因型频率过低，仅有1例，无法排除假阳性，故未对其实验室指标进行分析。

2.4ARL15与其他实验室指标的相关性 在DN患者中对ARL15与其他实验室指标进行了相关性分析，发现ARL15与PA有相关性(r=0.372，0.014)，与FPG、DBP、TC、TG、LDL-C、HDL-C、CRE、BUN、INS、IR无相关(r=0.061，-0.120、-0.031、-0.040、-0.073、0.149、-0.262、-0.234、-0.146、-0.050，P=0.697、0.443、0.844、0.799、0.643、0.341、0.090、0.131、0.349、0.751)。

3 讨 论

T2DM是复杂的内分泌系统疾病，发病机制与遗传和环境因素有关，不同种族之间也存在差异。ARL15基因于2009年首次通过GWAS研究被发现作为T2DM相关风险基因〔13〕。ARL15参与调节膜转运、脂质组成和胰岛素信号转导途径，同时也参与炎症反应过程。PA是一种含量丰富的血浆蛋白，通过提高胰岛素敏感性、改善胰岛β细胞功能和脂肪酸β氧化，在 T2DM 发生和发展中起重要作用。研究表明，ARL15基因的常见遗传变异与血浆PA、胰岛素、HDL-C浓度、肥胖和冠状动脉粥样硬化有关〔19～22〕。近期研究发现ARL15在脂肪细胞分化和PA分泌中着重要作用，且ARL15单倍体功能不全具有导致脂肪营养不良的可能性〔23〕。因此，ARL15多态性可能与外周血PA水平相关，影响PA的分泌，PA水平降低可能引发肥胖、T2DM等代谢性疾病的发生。

以往研究分析了ARL15、TCF7L2和PGC-1α 3个基因多个SNPs在延边地区朝鲜族和汉族人群与T2DM和T2DM合并大血管病变的相关性。对ARL15基因单个SNP进行分析时，其对T2DM的作用较小，累加其他基因位点后，可能增加罹患T2DM的风险〔24～26〕。这些研究为本研究对T2DM合并微血管病变的探究奠定了基础，也充分说明了多基因遗传病具有微效基因累加效应的特征。本研究首次报道了延边地区朝鲜族和汉族人群ARL15基因多态性与T2DM和DN的关联，分析了其单倍型及联合基因型与DN的关联，并进一步探讨了ARL15与其他实验室指标之间的相关性。

本实验结果提示携带单倍型CCGA和CTAG人群会增加罹患DN的风险，联合基因型CT-CT-AG-AG和 CC-CC-AG-AG可能通过调节TG和PA水平，增加IR，诱发血脂紊乱，增加T2DM罹患DN的风险。由于DN组患者例数较少且CC-CC-AG-AG基因型在T2DM组仅有1例，因此需要在更大的队列中进行验证。总而言之，以上研究结果从分子遗传学机制上，为探讨T2DM及DN提供了一个新的研究方向和依据。