青蒿素对自发性系统性红斑狼疮小鼠腰椎骨密度及力学的影响

朱觉新，黄永梅，黄连芳*（广东医科大学 .广东天然药物研究与开发重点实验室；.海洋医药研究院，广东湛江 5403）

自发性系统性红斑狼疮(SLE)的病因尚不完全清楚，多与遗传、环境和雌激素等因素有关[1]。系统性红斑狼疮致股骨头坏死[2]，骨密度下降和长期应用糖皮质激素治疗患者易发生骨坏死[3]，超声下可见骨侵蚀、滑膜增生、能量多普勒超声滑膜炎、腱鞘炎等多种病变[4]；未发现骨坏死患者皮质骨发现空骨陷窝，骨小梁中央可见无活力骨细胞，其周围有炎性细胞浸润[5]，股骨头部分骨细胞体积缩小，伴核固缩，较多骨细胞坏死溶解成碎片，伴成骨细胞凋亡[6]。Nevskaya等[7]整理文献发现无症状的骨坏死发生率达 28.52%，因此，结缔组织病患者存在不同程度的骨代谢异常，骨质疏松发生率较高[8]。青蒿为菊科植物黄花蒿的地面上的干燥部分，味苦、辛，性寒，归肝、胆经，具有清虚热、除骨蒸、解暑热、截疟、退黄的功效[9]，其主要有效成分为青蒿素，青蒿素类衍生物为蒿甲醚、双氢青蒿素(DHA)等。近年来发现青蒿及其有效成分和衍生物治疗系统性红斑狼疮、皮肤病如湿疹、光敏感性皮肤病等具有良好疗效[10]，苏颖杭等[11-13]观察青蒿素硫酸羟氯喹复方的中、高剂量组对大鼠佐剂性关节炎有一定的抗炎作用，青蒿素干预治疗MRL/lpr狼疮鼠，血清及肾组织MDA水平均明显升高。目前青蒿素治疗SLE的疗效研究主要集中在免疫抑制和抗炎方面，对于青蒿素及其衍生物治疗红斑狼疮后骨骼的改变如何，特别是腰椎骨密度和力学变化少见报道。本研究通过观察青蒿素对 SLE小鼠腰椎骨密度及力学的影响，为 SLE导致的骨损坏的青蒿素临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 药物

青蒿素的衍生物二氢青蒿素(71939-50-9，批号K913006-CN30，纯度≥98%，上海笛柏生物科技有限公司)，经食用油配成1.5%的溶液，给药剂量150 mg/kg。醋酸泼尼松片(批号160604，广东华南医药集团有限公司)，剂量6 mg/kg，用生理盐水配成0.06%的混悬溶液。

1.2 动物与分组

24只红斑狼疮小鼠[购买于南京大学模型动物研究中心的实验鼠，动物生产许可证号：SCXK(苏)2015-0001：6周龄雌性 B6.MRL-Faslpr/J小鼠(供体株MRL/MpJFaslpr，背 景 株 C57BL/6J，狼疮小鼠(20.0±2.0) g、C57BL/6J野生型小鼠]在广东医科大学动物中心屏蔽系统环境中饲养，质量合格证明No.32002100001211，按“广东省实验动物监测研究所和国家实验动物监测研究所实验动物保护和使用指南”进行饲养。将其随机分为3 组，即青蒿素组、泼尼松组和生理盐水组，每组8只。另选取 8只健康的 6周龄 C57BL/6J野生型(WT)小鼠作为对照组(健康对照组)，每组分笼饲养。

1.3 实验仪器

瑞士小动物活体显微成像CT(Scanco Micro-CT VIVA 40)，美国生物力学仪(ElectroForce，3200 Series)。

1.4 方法

1.4.1 给药 根据人类 SLE的治疗剂量换算或参考文献[7]等确定二氢青蒿素、醋酸泼尼松给药剂量，保持湿度50%～60%，室温24～28℃等实验动物饲养条件。(1)青蒿素组：二氢青蒿素，150 mg/kg，灌胃，1次/d；(2)泼尼松组：醋酸泼尼松，6 mg/kg，灌胃，1次/d；(3)生理盐水组：生理盐水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d；(4)健康对照组：生理盐水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d。用药90 d后，小鼠眼球取血处死后取材，左侧胫骨 Scanco Micro-CT VIVA 40扫描、骨三维重建；腰椎3、4 节行生物力学压缩性能试验。

1.4.2 扫描、骨三维重建 取腰椎进行高分辨率Scanco Micro-CT VIVA 40扫描、三维重建，参数如下：X球管电压70 KVP，最大功率8 W，焦点直径7 μm，图像矩阵4096×4096像素，扫描尺寸38.9 mm×145 mm，CPU r×2800 i2。3D骨重建和图像分析骨微结构参数：总体积、骨骼体积、骨体积分数、连接性骨密度、结构模型指数、骨小梁数量、厚度、骨组织骨密度、骨小梁分离度等。

1.4.3 生物力学腰椎压缩性能测试 实验结束后，剔除腰椎第3、4节的肌肉及软组织，用生理盐水纱布将其包裹，再用锡纸、密封袋装好，负 20℃冰箱冷存，检测时恢复室温，通过生物力学测试仪进行压缩性能实验。仪器设置参数：椎体正中线为加压点，Limits(Load -40,450)，加载速率2.0 mm/min，自动记录 Load等对应的最大载荷参数等。Load性能测试指标包括弹性模量、弹性载荷、最大载荷、断裂载荷等。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 腰椎微结构参数比较

与生理盐水组、泼尼松组相比，青蒿素组小鼠的骨小梁数量、骨体积分数、连接性骨密度与骨组织骨密度均明显增加，骨小梁分离度与结构模型指数均明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与健康对照组比较，青蒿素组小鼠的腰椎微结构指标的差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1、图1。

2.2 生物力学腰椎压缩性能测试指标

与生理盐水组、泼尼松组比较，青蒿素组小鼠的弹性载荷、最大载荷、断裂载荷明显增加(P＜0.05)，与健康对照组比较，青蒿素组小鼠的生物力学腰椎压缩性能指标差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

3 讨论

SLE疾病导致骨代谢异常、微结构变差，骨吸收明显增加，骨形成抑制，骨量丢失，骨质侵蚀，软骨破坏，关节畸形，力学性能也随之下降。SLE普遍发生骨密度(BMD)下降，骨质疏松发生率显著升高[14]。激素治疗虽然改善了小梁微结构，但骨生物力学性能和骨质量没有得到缓解，且长期激素治疗易发生激素性股骨头或肱骨头坏死、肌无力、冠状动脉病变，肾性高血压、长期加重心脏负荷等引起高脂血症、心绞痛、心肌损害及心力衰竭等。有研究显示，长期服用小剂量泼尼松，骨密度有显著的降低，服用大剂量泼尼松，骨股头坏死的发生率越高[15-16]。Lucinda等[17]观察到成骨细胞的 Bax表达在糖皮质激素诱导的骨质疏松症中增加。分析原因可能是激素使机体的凝血-纤溶系统存在明显的功能障碍[18]。本研究结果中显示，使用泼尼松治疗SLE可使骨吸收有所下降，骨小梁稀疏变薄，骨量减少，分离度增加，连接骨密度和骨小梁密度明显下降，改善了小梁微结构，但与健康对照组比较，腰椎微结构与生物力学腰椎压缩性能等指标的差异仍有统计学意义(P＜0.05)，即不能恢复至正常。

表14组小鼠腰椎微结构参数变化(±s， n=8)

表14组小鼠腰椎微结构参数变化(±s， n=8)

与健康对照组比较：aP＜0.05；与生理盐水组比较：bP＜0.05；与泼尼松组比较：c P＜0.05

图1 青蒿素对SLE小鼠腰椎的三维结构图

表2 药物治疗对自发性红斑狼疮小鼠腰椎生物力学变化的影响(±s， n=8)

表2 药物治疗对自发性红斑狼疮小鼠腰椎生物力学变化的影响(±s， n=8)

与健康对照组比较：aP＜0.05；与生理盐水组比较：bP＜0.05；与泼尼松组比较：c P＜0.05

青蒿为菊科植物黄花蒿，现代中药药理学证明青蒿的主要成分是青蒿素，具有抗疟、抗炎、解热、镇痛、抗病毒、抗菌等作用[19]。近年来发现其具有抗炎及免疫调节作用而广泛应用于红斑狼疮、类风湿关节炎等治疗。已有研究证实，青蒿素的药理作用机制与Wnt/β-Catenin、NF-κB、RasMAPK、PPAR、Notch等信号通路相关[20-21]，这些通道都与成骨细胞、破骨细胞的分化增殖、功能调节密切相关，特别是对成骨细胞调控相关信号通道的影响。实验结果表明，与生理盐水组、泼尼松组相比，青蒿素组骨小梁数量、骨体积分数、连接性骨密度、骨组织骨密度、断裂载荷、最大载荷、弹性载荷等均明显增加(P＜0.05)，骨小梁分离度与结构模型指数均明显减少(P＜0.05)，与健康对照组比较，青蒿素组腰椎微结构与生物力学腰椎压缩性能等指标的差异均无统计学意义(P＞0.05)。说明青蒿素改善 SLE所致的骨量减少、连接密度与小梁密度明显下降、骨吸收明显增加等骨微结构和生物力学腰椎压缩性能，骨代谢正常，且有效阻止 SLE导致的小鼠骨量丢失，显著抑制其骨吸收增加，不降低骨形成。

综上所述，青蒿素改善 SLE所致的骨微结构恶化和骨生物力学压缩性能下降，阻止 SLE导致的小鼠骨量丢失。文章主要研究二氢青蒿素的作用，实验设计中只有1个剂量组。本实验是预实验，目的是初步观察二氢青蒿素对 SLE小鼠骨损害的防治作用。本文中二氢青蒿素的剂量是根据临床上二氢青蒿素治疗 SLE的剂量换算而来。根据本实验的结果，我们下一步接着要做二氢青蒿素高、中、低剂量对 SLE骨损害的干预作用，筛选出最佳使用剂量范围，为其临床合理应用提供依据。