甘草叶片形态结构和光合作用对干旱胁迫的响应

张 东 刘 艳 张 晗 张子健 王 洋 刘美岑

（1.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，呼和浩特 010011；2.内蒙古农业大学内蒙古野生特有蔬菜种质资源与种质创新重点实验室，呼和浩特 010011）

植物一生固着于地面，因而更易遭受生物和非生物逆境胁迫。在长期进化过程中，植物从形态结构、生理生化等诸多方面演化形成一套完整的适应机制以抵御逆境胁迫。叶片作为地上部感知外界环境最敏感器官，其形态结构表现出与环境之间良好的适应协同性，如叶片表面蜡质可以抵御病原微生物和虫害以及其他生物胁迫和非生物胁迫［1～2］，表皮腺体分泌物对生物胁迫和非生物胁迫［3］，角质膜调节非气孔性蒸腾与体表温度［4］和防御病虫害叮咬［5～6］等。气孔是植物叶片特有的结构，在调节植物与环境之间气体交换、水分扩散中发挥重要作用。

干旱胁迫下植物叶片常通过调节气孔导度，增加气孔阻力以减少水分丧失。此外气孔密度、气孔大小和气孔形态结构等也与植物抗旱性密切相关［7］。腺毛（腺体）是陆生植物地上部分表面广泛分布的特殊结构，它们具有合成、贮存和分泌次生代谢产物以及反射强光降低叶温、减少蒸腾等功能，在植物防御外界生物和非生物胁迫中起着重要作用。因此，了解叶片气孔、腺体等结构特征以及对逆境胁迫的响应是阐明植物抗逆机理的重要内容。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrhiza）多年生草本植物［8］，多生长在干旱、半干旱荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带。其根系发达，抗性强，是荒漠半荒漠地区改良土壤、保持水土、防风固沙的重要植物。目前，关于甘草抗旱性研究多集中在植株抗氧化系统［9～11］、种子萌发特性［12］、次生代谢［13～14］等方面，对干旱胁迫下甘草叶片形态结构研究较少。本试验采用盆栽控水模拟土壤干旱的方法，研究不同干旱胁迫程度对甘草幼苗叶片表面结构特征和光合作用的影响，旨在了解叶片表面结构对干旱逆境的响应特征，为阐明甘草抗旱机理提供重要的形态学和生理学依据。

1 材料和方法

1.1 材料及处理

试验于2018 年3 月至9 月在内蒙古农业大学实践教学基地进行。甘草种子由内蒙古天创药业科技股份有限公司提供。挑选充实饱满的甘草种子，浓硫酸浸种后人工催芽，将均匀露白的甘草种子点播于花盆（高20 cm、直径为22 cm）中，盆土以细沙和营养土5∶3 组成（V/V），每盆填充7 kg，出苗后正常管理。待幼苗长至4～5 片真叶时间苗，每盆保留生长一致、健壮苗20 株，生长2 个月后开始处理。试验共设4 个处理，即正常供水对照（CK）、轻度干旱胁迫（light stress，LS）、中度干旱胁迫（moderate stress，MS）、重 度 干 旱 胁 迫（severe stress，SS），每处理8盆。4个处理的土壤相对含水量（SRWC）分别为75%±3.0%、65%±1.6%、50%±1.9%、35%±2.5%。自然干旱至不同处理水平，称重控制土壤水分含量，并于每天18：00左右补充水分来保持不同干旱胁迫水平。10 d 后，不同处理植株受害程度出现明显差异时结束处理，取样并测定相关指标。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 土壤含水量测定

采用鲍士旦［15］的方法。

1.2.2 光合指标测定

采用CIRAS-3 便携式光合仪（购自汉莎科学仪器有限公司）测定。每个处理随机选取10 片植株中部成熟叶片，测定其净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）。

1.2.3 叶片扫描电镜观测

参照李柏年等［16］方法略有改动。取每个处理甘草植株顶端新叶、中部成熟叶和基部衰老叶，避开主脉，用刀片分别切取8 mm×5 mm的叶肉组织，2.5%戊二醛固定2 h，抽气下沉，不同浓度乙醇梯度脱水，临界点干燥及喷金处理，扫描电镜观察并照相。每个处理选取10个视野，统计气孔密度、气孔开张比并测量气孔开张度。气孔开张度为每个视野随机选取10 个开张气孔，测量气孔孔径宽度并计算平均值；气孔开张比为每个视野中开张的气孔数占总气孔数的百分比。

1.3 数据处理分析

试验数据用Excel 2013 整理，SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析，Sigma Plot软件作图。

2 试验结果

2.1 干旱胁迫对甘草叶片形态结构的影响

利用扫描电镜分别观测不同干旱胁迫程度下、不同发育状态（顶端新叶、中部成熟叶、基部衰老叶）甘草叶片形态结构。在叶上下表面均观察到气孔、腺毛和具分泌功能的腺体结构。且上述结构表现出不同叶部位、不同发育程度和不同干旱胁迫程度的差异性（见图版Ⅰ）。

2.1.1 气孔结构

叶片上下表皮均观察到有大量气孔结构存在（见图版Ⅰ：A～B），气孔有开张、微开张和闭合；有与叶表面相平或突出叶表面等不同形态（见图版Ⅰ：C～F）。且气孔形态、密度等在上下表皮间、叶片不同发育程度间、干旱胁迫处理间有显著差异。如表1所示，不同干旱胁迫处理下，无论是新叶、成熟叶还是衰老叶，叶片下表皮气孔密度均显著高于上表皮，下表皮气孔密度均值为196.0 个·mm-2，上表皮气孔密度仅为67.2 个·mm-2。正常供水条件下，成熟叶下表皮气孔密度最高，为260个·mm-2，其次为新叶216.7 个·mm-2，衰老叶最低，为167.3 个·mm-2；不同发育程度叶片上表皮气孔密度差异不大，均值为74.3 个·mm-2。干旱胁迫下，叶片上下表皮气孔总量（密度）总体均表现出较对照显著下降的变化趋势。其中，新叶在中度、重度胁迫下气孔密度较对照显著下降；成熟叶和衰老叶在轻度胁迫下气孔密度即较对照显著下降，且随着胁迫程度加深，气孔密度较对照下降幅度增加。

气孔开放程度是影响叶片内外气体交换和水分蒸腾的重要因素，气孔开张比和开张度是衡量气孔开放程度的2 个重要指标。如表1 所示，无论是正常供水的对照，还是干旱胁迫处理，植株新叶、成熟叶、衰老叶气孔开张比均表现为上表皮大于下表皮的特征。正常供水条件下，成熟叶气孔开张比最高，新叶和衰老叶相当，略低于成熟叶；随着干旱胁迫程度的加剧，3种类型叶片气孔开张比呈先升高后降低的变化趋势，即轻度胁迫下气孔开张比较对照有所上升，中度和重度胁迫下，气孔开张比较对照下降。

叶片上下表皮气孔开张度总体均值无显著差异，分别为1.19 和1.10 μm。正常供水条件下，气孔开张度表现为成熟叶＞新叶＞老叶；随着干旱胁迫程度加剧，气孔开张度同气孔开张比变化趋势基本一致，呈先升高后降低的变化趋势。

2.1.2 泌腺结构

扫描电镜观察到甘草叶片上下表皮均具分泌功能的腺体结构（见图版Ⅰ：G～H）。其分泌物在电镜下呈白色透明结晶状；分泌物在叶表面堆积，呈圆盘状高出于叶表面，圆盘直径约为50 μm；正常供水或轻度干旱胁迫下泌腺及其分泌物多呈光滑圆盘状（见图版Ⅰ：I），随着干旱胁迫程度加剧，中度和重度胁迫下腺体及分泌物有的出现周边皱褶，中间凹陷（见图版Ⅰ：J），有的呈中间分泌物聚积、破损（见图版Ⅰ：K）。泌腺在叶片上下表皮分布数量不均，在下表皮分布数量大于上表皮。正常供水条件下，新叶和成熟叶泌腺数量相当，上下表皮总量分别为7.26 和7.63 个·mm-2，衰老叶仅为5.08 个·mm-2，显著低于新叶和成熟叶；干旱胁迫下，3种类型叶片泌腺数量均较对照有所增加。其中，轻度胁迫下，新叶和成熟叶泌腺数量即较对照显著增加，并一直维持较高水平至中度和重度胁迫；衰老叶则在重度胁迫下泌腺数量迅速增加，显著高于对照。

2.1.3 腺毛结构

利用扫描电镜同时观察到甘草叶片上下表皮具腺毛结构（见图版Ⅰ：G～H），腺毛长约90 μm，垂直于叶表面，基部较粗，呈圆环状，向上渐尖伸长，形似短毛。腺毛在叶肉组织和叶脉表面上均有分布。正常供水条件下，3种类型叶片上下表皮间腺毛数量无显著差异，约为4.96 个·mm-2；干旱胁迫下，3 种类型叶片腺毛数量均有所增加，其中新叶在轻度胁迫下腺毛数量即较对照显著增加，至中度胁迫达最多，较对照增加了174.26%，到重度胁迫下腺毛数量降至与对照相当水平；成熟叶则在中度和重度胁迫下腺毛数量显著增加，较对照增加了203.96%；衰老叶仅在轻度胁迫下较对照有小幅增加，中度、重度胁迫下腺毛数量均与对照相当。

表1 干旱胁迫下甘草叶片表皮气孔形态结构Table1 Leaf epidermal morphology of G.uralensis under drought stress

表2 干旱胁迫下甘草叶片表皮腺体分布Table 2 Epidermal gland density in leaves of G. uralensis under drought stress

表3 干旱胁迫下甘草叶片表皮腺毛分布Table 3 Epidermal glandular trichome density in leaves of G.uralensis under drought stress

2.2 干旱胁迫对甘草叶片光合特性的影响

叶片的主要功能是进行光合作用，干旱胁迫影响叶片的形态结构，进而对其功能造成影响。本研究测定了不同干旱胁迫程度下甘草成熟叶片光合相关指标，结果如图2 所示。正常供水条件下，甘草成熟功能叶Pn为8.2 μmol·m-2·s-1，轻度胁迫下，叶片仍维持较高的Pn，与对照差异不显著；中度胁迫下，叶片Pn较对照下降了23.17%，差异显著水平；重度胁迫下，叶片仅维持极微弱的Pn。气孔导度是表示气孔张开程度的重要指标，随干旱胁迫程度加深，甘草叶片气孔导度呈先升高后降低的变化趋势，即轻度胁迫下较对照有小幅升高，中度胁迫下较对照显著下降，至重度胁迫气孔导度降至极低水平。干旱胁迫下叶片蒸腾速率变化趋势与气孔导度一致，呈轻度胁迫下小幅升高，中度和重度胁迫下较对照显著下降。胞间CO2浓度在正常供水和轻度胁迫下均维持相对稳定水平，约为247.5 mg·L-1；中度胁迫下Ci较对照下降了23.40%，达差异显著水平；重度胁迫下，甘草叶片Ci迅速升高，为对照的2.4倍。

3 讨论

叶片是植物进行光合作用的主要器官，气孔是叶表面特有的形态结构，植物通过气孔与外界环境进行水分和气体交换，气孔开度控制着植物的光合作用以及蒸腾作用［17～18］，从而影响叶片水势。因此，气孔的形态建成、分布密度以及开放程度等均直接影响植物光合作用以及蒸腾作用。大量研究均证实，气孔在叶表面分布不均，主要分布在下表面［19］。本研究同样观察到，甘草叶片气孔在下表面分布密度远高于上表面。正常供水条件下，不同发育程度叶片表皮气孔密度成熟叶＞新叶＞衰老叶，以及气孔开张度也表现为成熟叶＞新叶＞衰老叶。这可能是随着分生组织细胞成熟，最终分裂为气孔，因而随着叶片成熟，单位面积上气孔数量增多［20］，然而随着叶片衰老，气孔也随着发生PCD，继而气孔密度减小。

植物抵御干旱胁迫主动适应环境的一个重要调节因素就是气孔调节［21］，干旱胁迫会诱导植物的气孔出现微形态的变化，如气孔密度增大［22］、气孔开度减小［23～24］、气孔下陷、气孔器长度和宽度显著减小等［25］，以使植物抗性提高。本试验结果显示，随着干旱胁迫程度的加剧，叶片总气孔密度、气孔开张比呈先增大后减小的趋势；而气孔开张宽度呈逐渐减小的趋势，可能是气孔密度的增加有助于植物更好地控制呼吸作用，调节体内H2O和CO2的进出，同时脱落酸（ABA）触发保卫细胞释放K+，保卫细胞渗透压和体积的降低导致气孔开张宽度逐渐减小，甚至关闭。与张晓艳等［26］研究发现气孔密度随干早程度的加剧呈先增加后减小结果一致，说明干旱胁迫程度加速了气孔细胞的程序性死亡所造成的［27］，与赵殊丽［28］、齐红岩等［29］、高彦萍等［30］的研究气孔密度逐渐增大结果不同，这可能是甘草叶片具有表皮毛、腺体等适应干旱的特征，对干旱逆境胁迫具有交叉适应性，既能提高植株的抗旱能力，又能降低其在干旱环境下所受到的伤害。

旱生植物叶表皮及其附属物发生明显变化，如表皮毛、腺毛、瘤状或乳状突起等。杨九艳等［31～32］认为表皮毛反射强光使得叶片降温，免受灼伤，可代替蒸腾作用而间接减少蒸腾用水。宋玉霞等［33］对贺兰山几种旱生灌木叶表皮进行了扫描电镜观察，认为表皮毛的附着可起到防止日灼，对叶表皮细胞和叶肉细胞均起着很大的保护作用，还可以在气孔开放时起保护作用，减少水分的蒸腾。本试验结果显示，在正常供水下，泌腺及其分泌物多呈光滑圆盘状，泌腺在叶片上下表皮分布数量不均，在下表皮分布数量大于上表皮，其中衰老叶泌腺数量显著低于新叶和成熟叶，可能是干旱胁迫导致叶片PCD，继而影响了泌腺发育；随着干旱胁迫程度的加剧叶片上表皮和下表皮腺体密度总数整体上呈增大的趋势，腺体颜色随着干旱胁迫程度的加剧逐渐加深，形状出现不规则褶皱和内陷，3 种类型叶片腺毛数量均比对照多，表明甘草叶片表面的腺体特征参与抗旱逆境调节，从而避免甘草植株受到干旱逆境胁迫的伤害。这与Randhawa 等［34］研究发现抗性强的品种具有数量更多的腺毛结果一致。

干旱胁迫对植物光合作用的影响范围很广，从限制CO2向叶绿体的扩散，限制茎和根产生的激素介导的气孔开放，到限制CO2向叶肉运输，以及改变叶片中光化学反应和碳代谢过程。这些影响随着胁迫的强度和持续时间以及叶片的年龄（老叶片更容易受到干旱的影响，积累更多的盐分）和植物种类而变化［35］。近年来的研究表明，在快速或轻度干旱条件下，气孔限制是光合作用下降的主要原因，而缓慢干旱、中度干旱或严重干旱条件下，光合作用主要受非气孔因素限制。植物受旱后，叶片光合作用受抑制的主要原因都有从气孔因素向非气孔因素转变的过程，其转变时间因植物的抗旱能力、干旱程度及施加方式等因素而异。在干旱胁迫下，植物吸水受阻导致体内水分缺乏，蒸腾速率会逐渐减缓，以维持植物基本代谢活动，这是植物抵御干旱胁迫的防御机制［36］，气孔导度是蒸腾速率大幅度下降的主要原因。研究表明Pn与Gs和Tr呈显著正相关，是由于气孔在植物光合气体交换中影响着Pn和Gs的过程，其调节能力是植物适应水分逆境的主要措施之一［37］。Valladares等［38］研究发现在小麦开花后，小麦叶片净光合速率随干旱胁迫程度的加剧呈先增大再减小的趋势。本试验结果显示随着干旱胁迫程度的加剧，甘草幼苗叶片的Pn、Tr、和Gs都呈现先升高后降低的趋势；在轻度干旱胁迫时，Pn、Tr、和Gs显著高于CK，这可能是甘草叶片表面气孔影响所致。而Ci呈逐渐上升的趋势，在重度胁迫时迅速增高，这与Y.Ohashi［39］等研究结果一致，表明在重度干旱胁迫下甘草幼苗失去抗旱能力，以及限制甘草幼苗光合作用的因素是由非气孔因素导致的。