乙基多杀菌素在杨梅果实和土壤中的残留消解特征及其安全性评价

王天玉，林媚，姚周麟，王鹏，平新亮，方华

（1.浙江省农业科学院浙江省柑橘研究所，浙江 台州318026；2.浙江大学农业与生物技术学院农药与环境毒理研究所，杭州310058）

杨梅是我国著名的特色果树[1]，栽培面积占全球的99%以上，其果实营养丰富，富含糖、酸和可溶性固形物等，还含有钙、钾、镁、锌、硼、铜和铁等多种矿质元素，深受消费者青睐。但杨梅在种植过程中会遭受多种病虫的危害，目前主要依赖化学农药防治，给杨梅的质量安全带来了隐患[2]。乙基多杀菌素（spinetoram）作为新型的多杀菌素类生物农药，由放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生[3]，系天然菌株发酵后的代谢产物，其原药的有效成分是乙基多杀菌素-J（XDE-175-J）和乙基多杀菌素-L（XDE-175-L）的混合物（质量比为3∶1），二者的生物活性之间并无显著差异。乙基多杀菌素在我国主要登记用于十字花科蔬菜以及茄、柑橘、棉花等作物上，对鳞翅目幼虫、蓟马、甜菜夜蛾、潜叶蝇等有较好的防治效果[4-6]；随着其防治效果的日益显著，防治作物也越来越广，尤其对杨梅果蝇防治有一定的特效[7-8]。

乙基多杀菌素属于易降解农药，如果使用不合理，会有农药残留超标的风险，但目前有关乙基多杀菌素在杨梅及其土壤生态系统中消解动态的研究报道较少。国内外关于乙基多杀菌素在环境中的残留分析方法和消解残留的研究已有不少报道[9-13]，其中分析方法有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）[11-12]和液相色谱-串联质谱法[9-10,13]，主要集中在水稻[10]以及蔬菜[13]、土壤[14]、果实[15]等环境中，如：刘赛等[15]研究了乙基多杀菌素在宁夏枸杞中的降解动态，采用乙腈提取，氯化钠分层后，液质联用直接进样，发现该药在鲜枸杞和干果中的半衰期分别为3.65 和4.05 d；MALHAT[11]研究了乙基多杀菌素在番茄中的残留情况，样品采用含1%三乙胺的乙腈提取，N-丙基乙二胺（primary secondary amine,PSA）净化，高效液相色谱法测定，消解动态表明，该药的半衰期为2.62 d。

QuEChERS（快速、简便、便宜、有效、稳定、安全）方法是近年来一种用于农产品农药检测的快速样品前处理技术，由美国农业部ANASTASSIADES教授等于2003 年开发；与固相萃取类似，该方法是在提取液中加入合适的吸附剂，利用吸附剂与基质中杂质的相互作用来吸附杂质，从而达到除杂净化的目的，具有成本低、环保、节省溶剂的优点。本研究采用该方法对样品进行前处理，选取吸附剂PSA和硫酸镁进行净化，用超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）测定，建立了杨梅果实和土壤中乙基多杀菌素残留量分析方法，并参考农药残留试验准则的要求进行了杨梅果园中乙基多杀菌素的消解动态和最终残留试验，以期为该药在杨梅或其他水果中的残留检测研究及在果园中的安全合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AB 4500 型超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（美国AB SCIEX 公司）；MX-GX1561 匀浆机（日本松下厨房电器有限公司）；AR1502CN 电子天平（美国Ohaus 公司）；MS3 旋涡机（德国IKA 公司）；FA25 高速分散均质机（上海弗鲁克公司）；SK250KUDOS超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；AnkeTDL-40B 离心机（上海安亭科学仪器厂）；Milli-Q超纯水系统（德国Millipore公司）。

乙基多杀菌素（spinetoram）标准品（95.0%，德国Dr. Ehrensorfer 公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、硫酸镁（美国Agilent 公司）；乙腈（HPLC 级）、乙酸铵（优级纯）、氯化钠（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司）；60 g/L 乙基多杀菌素悬浮剂（美国Dow AgroSciences公司）。

1.2 田间试验

2017—2018年，分别在浙江省台州市浙江省柑橘研究所试验站和福建省福安市昌运种植专业合作社进行田间试验，参照农药残留试验准则方法进行设计，试验用药为60 g/L 乙基多杀菌素悬浮剂。这2片果园在试验前2年均没有施用过乙基多杀菌素。每个试验处理小区设3 个重复，每个小区4 棵杨梅树，另设不喷药的对照小区，各个小区之间间隔1棵树作为保护行，避免交叉污染。

1.2.1 杨梅果实中乙基多杀菌素的消解动态试验

杨梅生长周期从挂果到成熟需要2个月，转色期为20 d左右，时间较短，因此，于果实膨大期结束后开始喷药，保证处理小区内杨梅果实都均匀着药，喷施1次。分别于施药后2 h及1、2、3、5、7、10、14、21 d随机采集果树上、下、内、外、向阳和背阴面生长正常且无病虫害的果实，每个样品的采集量不少于1 kg，去除果核，将果肉打浆后于-20 ℃冰箱中保存，待测。同时，采集未喷药杨梅样品作为空白对照。

1.2.2 果园土壤中乙基多杀菌素的消解动态试验

在未使用过乙基多杀菌素的同一块果园内选取30 m2小区，用乙基多杀菌素喷施地面1 次，喷雾量为3 000 L/hm2。分别于施药后2 h及1、2、3、5、7、10、14、21 d随机取样，设5～10个采样点，分别采集0～10 cm 土层土壤，每次采样量不少于1 kg，土壤鲜样过1 mm 筛（不能过筛的土壤样品去掉植物残枝和石砾后保存），留样300 g，于-20 ℃冰箱中保存，待测；同时，测试土壤鲜样水分含量，用于校正干土残留量，并采集未喷药土壤样品作为空白对照。

1.2.3 乙基多杀菌素在杨梅果实和土壤中的最终残留试验

设2 个施药剂量，分别含有效成分乙基多杀菌素40和60 mg/L，各设2次和3次施药，共4个处理，施药间隔期为7 d，2 次施药比3 次施药晚7 d，各处理的最后一次施药均于果实膨大期结束后喷施。分别在施药结束后7、14 和21 d 采集杨梅果实和土壤样品。杨梅果实的采集和处理按1.2.1节进行；土壤样品采集深度为0～15 cm，其他采集方式和处理按1.2.2节进行。

1.3 分析方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 杨梅果实

称取果肉样品5.00 g（精确到0.01 g）至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，匀浆1 min，然后超声处理10 min，接着加入5 g 氯化钠，涡旋摇匀，以4 000 r/min离心10 min后，取上清液1 mL至离心管中；加入50 mg 吸附剂PSA，涡旋1 min，以4 000 r/min 离心2 min后，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后待测。

1.3.1.2 土壤样品

称取土壤样品5.00 g（精确到0.01 g）至100 mL离心管中，加入5 mL水和10 mL乙腈，涡旋2 min，然后超声处理10 min，接着加入5 g氯化钠，涡旋摇匀，以4 000 r/min 离心10 min 后，取上清液1 mL 至离心管中；加入50 mg吸附剂PSA，涡旋1 min，以4 000 r/min离心2 min后，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后待测。

1.3.2 仪器检测条件

1.3.2.1 色谱条件

Agilent C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm×1.7 μm）：柱温30 ℃；流动相A为10 mmol/L乙酸铵，流动相B为乙腈；流速0.3 mL/min；进样量5 μL。梯度洗脱条件：B 相在0～2.00 min 内保持体积分数为5%；2.00～5.00 min 内线性增加至95%，保持2.00 min；7.00～7.10 min内线性恢复至5%，保持2.90 min。

1.3.2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源，正离子模式；扫描方式为多反应监测模式；离子源温度500 ℃，电喷雾电压5 500 V；窗帘气压275.80 kPa（40 psi）；雾化气压344.75 kPa（50 psi）；辅助加热气压344.75 kPa（50 psi）；碰撞气压62.055 kPa（9 psi）；碰撞能量、去簇电压和其他参数如表1所示。

表1 乙基多杀菌素的UPLC-MS/MS检测参数Table 1 UPLC-MS/MS parameters for spinetoram

1.3.3 标准曲线的绘制

采用外标法定量：称取适量的乙基多杀菌素标准品于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 mg/L 的标准工作溶液，再用乙腈逐级稀释配制成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.001 mg/L系列标准溶液，按1.3.2 节的条件进行测定，每个质量浓度重复3 次。以进样质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。乙基多杀菌素有效成分为XDE-175-J 和XDE-175-L 的混合物（质量比约为3∶1），峰面积用两者之和来表示。

1.3.4 添加回收率试验

分别称取5.00 g杨梅果肉空白样品和土壤空白样品，加入乙基多杀菌素标准品溶液，添加水平分别为0.005、0.05、0.5 mg/kg，按1.3.1、1.3.2和1.3.3节方法进行样品前处理及测定，每个水平重复5次。

2 结果与分析

2.1 QuEChERS方法的线性范围

在0.001～0.5 mg/L质量浓度范围内，乙基多杀菌素的峰面积（y）与质量浓度（x）之间呈良好的线性关系，回归方程为y=19 910 000x＋62 987，决定系数R2为0.999 8（R2＞0.999）。本试验同时采用样品空白基质配制标准溶液，得到基质匹配标准曲线，其与标准工作溶液曲线的斜率比为0.93，表明基质效应不明显，因此，对检测样品的试验结果采用标准工作溶液曲线进行分析。

2.2 QuEChERS方法的准确度、精密度和灵敏度

取空白对照的杨梅果实和土壤进行添加回收率试验。从表2 可知：在0.005、0.05 和0.5 mg/kg 添加水平下，杨梅果实中乙基多杀菌素的平均回收率范围为89.40%～101.85%，相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）为3.63%～7.25%；土壤中乙基多杀菌素的平均回收率范围为95.09%～102.66%，RSD为3.05%～3.61%，均符合农药残留分析方法的技术标准要求[16-17]。乙基多杀菌素的典型图谱如图1所示。用本方法确定土壤和果实中乙基多杀菌素的定量限（limit of quantitation,LOQ）均为5.0×10-3mg/kg；按S/N（信噪比）=3 计算得该药的检测限（limit of detection, LOD）为5.2×10-5mg/kg（表3）。说明该方法具有较好的准确度、精密度和灵敏度[10-11,13,15]。

2.3 乙基多杀菌素在杨梅果实和土壤中的消解动态

乙基多杀菌素悬浮剂按有效成分60 mg/L喷施1次，其在杨梅果实和土壤中的消解动态分别如图2和图3 所示。结果表明：在施药当天采样，浙江、福建2 年2 地杨梅中乙基多杀菌素的原始沉积量为0.453～0.568 mg/kg；施药2 d后，该药在杨梅果肉中的残留量为0.123～0.262 mg/kg，消解率超过50%；7 d后，果肉中的农药残留量为0.079～0.139 mg/kg，消解率为80%左右；14 d 后，果肉中农药的消解率达到90%。浙江、福建2 地土壤中乙基多杀菌素的原始沉积量为0.053～0.086 mg/kg；施药5 d后，土壤中农药的消解率为85%左右；施药7 d后，其残留量均未被检出。

本试验结果（表4）表明：乙基多杀菌素在杨梅和土壤中的消解动态均符合一级动力学方程ct=c0e-kt（ct为t时刻农药的浓度；c0为农药的初始浓度；k为降解速率常数；t为降解时间）。该农药在浙江、福建2 年2 地杨梅中的半衰期为4.4～5.2 d，土壤中的半衰期为1.2～1.9 d；根据我国农药在环境中的降解等级标准[16]划分，乙基多杀菌素属于易降解农药。

表2 乙基多杀菌素在杨梅果实和土壤中的添加回收率及相对标准偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of spinetoram in red bayberry and soil

图1 乙基多杀菌素在多反应监测模式下的提取离子流图谱Fig.1 Extracted ion current chromatograms of spinetoram at multiple response monitoring modes

表3 乙基多杀菌素在样品中的灵敏度对比Table 3 Sensitivity comparisons of spinetoram in samples

图2 乙基多杀菌素在杨梅果实中的消解动态Fig.2 Dissipation dynamics of spinetoram in red bayberry

图3 乙基多杀菌素在土壤中的消解动态Fig.3 Dissipation dynamics of spinetoram in soil

乙基多杀菌素作为一种具有胃毒和触杀作用的杀虫剂，施用后主要附着在植物体表面和土壤中，其降解速率受光照、温度、雨水等物理化学因素影响较大[17-19]。对土壤理化指标（表5）分析表明：浙江试验田为黄壤土，pH 6.17，含有机质35.1 g/kg、有效磷115 mg/kg 等；福建试验田为红壤土，pH 4.80，含有机质37.4 g/kg、有效磷75 mg/kg 等。在每年的6月，福建地区温度较浙江地区高，杨梅成熟期会提早10 d左右；同时，在杨梅成熟季节，2018年温度较2017年高，2地杨梅都较上一年提早10 d左右成熟。因此，2 地不同的土壤pH、有机质含量、温度、湿度及土壤微生物数量等因素对乙基多杀菌素的降解均有影响，从而导致相互之间有所差异。

2.4 乙基多杀菌素在杨梅和土壤中的最终残留量

测定结果（表6 和表7）表明：乙基多杀菌素分别采用40 和60 mg/L 剂量喷施，距末次施药7 d 后，杨梅果实中该农药的最终残留量为0.073～0.353 mg/kg，土壤中该农药的最终残留量为低于定量限～0.094 mg/kg；14 d后该农药残留量明显降低，杨梅果实中的最终残留量为0.027～0.152 mg/kg，土壤中的最终残留量为低于定量限～0.033 mg/kg；21 d 后农药降解较多，并逐渐趋于稳定的低值，杨梅果实中乙基多杀菌素的最终残留量为0.012～0.068 mg/kg，2地土壤中该农药残留均未被检出。

表4 乙基多杀菌素在杨梅果实和土壤中的消解动态方程及半衰期Table 4 Dissipation dynamic equations and half lives of spinetoram in red bayberry and soil

表5 浙江和福建2地土壤的理化指标Table 5 Physicochemical properties of soil from Zhejiang and Fujian

3 讨论

与传统的净化检测方法（如：刘赛等[15]用乙腈超声提取，UPLC-MS/MS法检测枸杞中的乙基多杀菌素，仪器的最小检出量为2.5×10-2mg/kg，定量限为5.0×10-2mg/kg；吴琼等[20]用乙腈、氯化钠和氢氧化钾溶液作为提取剂，固相萃取柱净化，超高液相色谱法检测土壤中乙基多杀菌素的含量，检测限为5.0×10-2mg/kg）相比，本研究建立了乙基多杀菌素在杨梅和土壤中的QuEChERS 残留分析方法。该方法采用乙腈或水作为提取剂，以PSA作为分散净化剂，利用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLCMS/MS）进行检测。结果表明：在0.005～0.5 mg/kg添加水平下，乙基多杀菌素在杨梅和土壤中的平均回收率为89.40%～102.66%，相对标准偏差（RSD）为3.05%～7.25%，定 量 限（LOQ）均 为5.0×10-3mg/kg，检测限（LOD）为5.2×10-5mg/kg。该方法快速、简便、溶剂使用少、环境友好，而且灵敏度高，可满足农药残留分析的要求，同时，也能为乙基多杀菌素在其他基质中的残留研究提供依据。

表6 乙基多杀菌素在杨梅果实中的最终残留量Table 6 Final residue of spinetoram in red bayberry

表7 乙基多杀菌素在土壤中的最终残留量Table 7 Final residue of spinetoram in soil

消解动态试验结果表明：乙基多杀菌素在杨梅果实和土壤中的半衰期分别为4.4～5.2 和1.2～1.9 d，且均符合一级动力学方程，土壤中的农药残留量在7 d 后均未被检出，2 年2 地的原始沉积量均小于国标规定的临时限量值1 mg/kg。最终残留试验选用不同施药剂量、不同施药次数（2次和3次）进行研究，结果发现：杨梅中乙基多杀菌素的最终残留量在7 d 后为0.073～0.353 mg/kg，土壤中的最终残留为低于定量限～0.094 mg/kg，14 d 后土壤中很难检测到乙基多杀菌素的残留，表明该药在土壤中的降解速率远比在杨梅果实中快。与夏西亚等[9]报道的乙基多杀菌素在香蕉中的半衰期为5.6 d，花瓣中的半衰期为4.5 d，土壤中的半衰期为6.5 d的研究结果相比，乙基多杀菌素在杨梅和香蕉中的半衰期比较相近，而在杨梅园土壤中的半衰期较香蕉园土壤中短。这与植物生长的季节和位置有关：杨梅主要生长在山坡上，其成熟期刚好为南方的梅雨季节，雨水冲刷较强，有助于土壤中乙基多杀菌素的降解。与陈国等[10]报道的乙基多杀菌素在水稻田中的消解动态相比，其在水稻中的半衰期仅为1.1 d，在稻田水中的半衰期为0.35 d，在土壤中的半衰期为6.8 d，说明环境和作物对乙基多杀菌素的降解影响较大，但总体结果显示，乙基多杀菌素消解速率较快，对自然环境影响较小，属于易降解农药[21]。

目前，国家针对乙基多杀菌素的最高残留限量（maximum residue limit, MRL）在各种作物上都是属于临时限量值，如：国标规定乙基多杀菌素在杨梅中的MRL 值为1 mg/kg（临时限量值），在桃中为0.3 mg/kg（临时限量值），在橙中为0.07 mg/kg（临时限量值）等[22]；FAO/WHO 规定其在番茄中的限量值为0.06 mg/kg。按农药资料登记要求，60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂在防治杨梅果蝇时应在杨梅采摘前7～10 d施用，每个作物周期的最多使用次数为2次。本研究按照使用说明进行了最终残留试验，结果显示，乙基多杀菌素的最终残留量低于国标规定的在杨梅中的临时MRL值，表明按照使用说明用该药防治杨梅树上的害虫是安全的。总之，该试验结果能够为该药的相关登记提供数据支持，对有效评价乙基多杀菌素的生态环境效应也具有重要意义。

4 结论

本研究建立了以乙腈或水作为提取剂，通过QuEChES法净化，采用液质联用测定杨梅和土壤中乙基多杀菌素的残留分析方法。乙基多杀菌素（60 g/L悬浮剂）在浙江和福建2年2地杨梅园的田间试验结果显示：其消解动态曲线符合一级动力学方程，该农药在杨梅中的半衰期为4.4～5.2 d，在土壤中的半衰期为1.2～1.9 d，属于易降解农药；按照乙基多杀菌素农药登记时的使用方法进行田间应用，安全间隔期7 d 后采样，其在杨梅中的残留量远小于MRL值（1 mg/kg临时限量值）。