基于酶联适体竞争法检测谷物制品中真菌毒素的研究

付少伟，孙淑敏，谢岩黎

河南工业大学 粮油食品学院，河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，河南 郑州 450001

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是一种主要由镰刀菌产生的雌激素类毒素，是世界上对粮食污染较广泛的真菌毒素之一，在谷物及农副产品中都可检测到其存在。该毒素会对生殖系统造成严重的损伤并有强烈的致突变、致畸作用，还能引起雌性激素中毒症及诱发肿瘤[1]。因此，世界各国对谷物或谷物制品中的玉米赤霉烯酮含量都制定了相应的限量标准。如欧盟规定精炼玉米油中ZEA不得超过200 μg/kg，我国规定食用谷物中ZEA不得超过60 μg/kg[2]。目前测定玉米赤霉烯酮的方法主要有仪器分析法(如高效液相色谱法、液质联用法等)及酶联免疫法(ELISA)等[3-8]。仪器分析法灵敏度和准确度高，但样品前处理复杂、成本高、需专业人员操作；ELISA法操作简便，灵敏度和特异性较好，是目前用于现场检测及大样本量筛查的主要方法，但ELISA的制备需要抗体，玉米赤霉烯酮这类小分子不具有完全抗原，其抗体制备成本高、周期长，易受环境的干扰，不易保存[9]。

核酸适体作为一种新型分子识别元件，具有可体外合成、易修饰、稳定性好等优势，被认为是抗体的良好替代物[10-11]。自玉米赤霉烯酮核酸适体被成功筛选以来，基于核酸适体构建玉米赤霉烯酮生物传感器(荧光法、比色法、电化学)的报道也日益增多[12-19]。酶联适体法与酶联免疫法原理类似，是以适体替代抗体作为识别元件，通过直接或间接竞争酶联法构建比色传感器。该方法已用于赭曲霉毒素A(OTA)、腺苷三磷酸(ATP)、卡纳霉素等危害因子的检测，都是以样品含量与反应颜色成反比关系进行定量[20-24]。作者以玉米赤霉烯酮为检测对象，基于目标物与ZEA适体链的高特异性结合，构建了间接竞争法检测ZEA的新方法。所设计的反应体系以样品质量浓度与体系颜色成正比关系进行定量，具有显色结果易判断、检测灵敏度高、成本低等特点，为食品中ZEA的检测提供一种简便、灵敏、经济的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ZEA核酸适体经生物素标记，序列为5′-bio-GAT GGG GAA AGG GTC CCC CTG GGT TGG AGC ATC GGA CA-3′[11]；与ZEA适体部分互补链DNA1经生物素标记，序列为5′-bio-TGT CCG ATG CTC CAA CC-3′；与DNA1完全互补链DNA2经生物素标记，序列为5′-bio- GGT TGG AGC ATC GGA CA-3′，以上DNA链均由上海生工生物工程有限公司合成并经HPLC纯化，使用前于-20 ℃冰箱保存，所有溶液(含缓冲液)均用一级超纯水配制。

辣根过氧化物酶标记生物素(HRP-Biotin)、链霉亲和素(SA)、过氧化物酶标记亲和素(HRP-SA)、牛血清白蛋白(BSA)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)：索莱宝公司；玉米赤霉烯酮标准品(ZEA)、黄曲霉B1标准品(AFB1)、赭曲霉A标准品(OTA)：Sigma公司；玉米赤霉烯酮免疫试剂盒(ELISA试剂盒)：上海快灵生物科技有限公司；玉米油、玉米粒：超市；试验用水为一级超纯水；甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

包被用碳酸盐缓冲液(CB)：0.05 mol/L，pH 9.6；PBS缓冲液：0.24 g磷酸二氢钾，1.44 g磷酸氢二钠，8 g氯化钠，0.2 g氯化钾，用浓盐酸调至pH 7.4，最后定容到1 L；洗脱液(PBST)：准确称取0.25 g Tween20，溶解于500 mL PBS缓冲液中。

1.2 主要仪器与设备

RT-6000酶标分析仪：深圳雷杜生命科学股份有限公司；QL-861漩涡振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PHS-3C型酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪(上海)有限公司；XO-1800D超声波细胞粉碎机：南京先欧生物科技有限公司；YX280A高压灭菌器：上海三申医疗器械有限公司。

1.3 试验原理

ZEA适体(aptamer)的5′端标记生物素基团(biotin)，通过生物素和链霉亲和素的结合作用，aptamer被固定到酶标板1上；DNA1为标记有辣根过氧化物酶(HRP)的适体部分互补链；DNA2是与DNA1完全互补的单链，通过生物素和亲和素固定到酶标板2上。当样品中不含ZEA时，DNA1与aptamer部分互补后固定在酶标板1上，酶标板2中加入TMB后不显色；当样品中含有ZEA时，由于靶物与适体特异性结合，使得DNA1解链处于游离状态。移取含DNA1的溶液至酶标板2中，标记HRP的DNA1通过双链互补配对原则被酶标板2中的DNA2捕获，催化TMB底物显蓝色，加入H2SO4终止反应后呈黄色，测定波长450 nm处的吸光度。因此，ZEA含量越高，与ZEA适体结合的越多，游离的DNA1越多，即捕获到酶标板2上的DNA1越多，催化TMB显色更深，吸光度越大。

1.4 方法

1.4.1 链霉亲和素包被酶标板的制备

选用碳酸盐缓冲液分别包被不同质量浓度的链霉亲和素(SA)(0、0.5、1、2、4、8、10、12 μg/mL)。将100 μL SA加入酶标板，37 ℃温育孵育16 h后，加入100 μL 1.5% BSA封闭1 h。用PBST洗去未固定的SA，得到SA包被的酶标板。在酶标板中加入100 μL HRP-Biotin后37 ℃温育1 h。PBST洗去未结合至酶标板上的HRP-Biotin，加入100 μL TMB 37 ℃孵育30 min后，加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度，优化链霉亲和素质量浓度和封闭液。

1.4.2 ZEA适体及互补链在酶标板上的包被

在链霉亲和素包被的酶标板1中加入100 μL 生物素标记的aptamer，在37 ℃孵育30 min，用PBST洗板3次；加入100 μL生物素标记的DNA1，37 ℃孵育30 min，用PBST洗板3次。以相同的方法在酶标板2上包被DNA1的互补链DNA2。利用TMB显色法优化适体、DNA1链和DNA2链的包被浓度。

1.4.3 酶联适体竞争法检测ZEA

将100 μL 不同质量浓度的ZEA分别加入到包被ZEA适体和互补链的酶标板1中，37 ℃孵育30 min后，将反应液移取到已包被Bio-DNA2的酶标板2中，37 ℃孵育30 min后，用PBST洗板3次；加入100 μL SA-HRP，37 ℃孵育30 min后，用PBST洗板5次；加入100 μL TMB，37 ℃孵育20 min后，加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应，测定波长450 nm处的吸光度。平行试验3次。

1.4.4 方法的特异性评价

采用本研究构建的酶联适体法同时对50ng/mL的玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素A(OTA)、雪腐镰刀菌烯醇(DON)和黄曲霉毒素B1(AFB1)进行测定，通过比较不同反应体系的颜色变化及D(450)评价本试验方法的特异性。

1.4.5 实际样品的检测

分别以建立的酶联适体法和市售酶联免疫试剂盒对ZEA加标质量浓度为50、100 ng/mL的玉米油和玉米样品进行检测。玉米样品依据GB/T 23504—2009进行预处理后得到滤液为实际样品液；玉米油样品的预处理参考孟卫芹等[23]的方法。对比两种方法的样品回收率和标准偏差，验证酶联适体法对实际样品检测的可行性。

2 结果与分析

2.1 包被方法和链霉亲和素质量浓度的优化

生物素标记的ZEA适体通过生物素-亲和素体系被固定在酶标板上。因此，酶标板上链霉亲和素的包被量与适体的固定量相关，从而影响酶联适体法的检测灵敏度。主要考察了包被方法和SA质量浓度对显色体系的影响。干法包被和湿法包被的选择通常与酶标板有关，本试验选用JET BIOFIL板。干法于37 ℃温育16 h至包被液完全烘干,湿法于4 ℃包被过夜(16 h)。结果如图1所示，干法包被的效果整体优于湿法包被；在0～4 μg/mL的范围内，随着SA质量浓度的增大，显色体系的吸光度不断增加，颜色逐渐加深。当SA溶液的质量浓度达到4 μg/mL时，干法包被和湿法包被在450 nm处的吸光度均基本达到稳定，表明SA在酶标板孔中的包被已达到饱和。因此，选择干法包被作为本试验的包被方法，4 μg/mL为SA的最佳包被质量浓度。

图1 不同包被方法及SA包被质量浓度的优化

2.2 封闭液的优化

为了避免试验过程中发生非特异性吸附，提高检测的准确性，需要在酶标板包被SA后加入封闭液封闭多余位点。考察了酪蛋白、BSA和明胶溶液3种常用封闭液的封闭效果。由图2可知，在最优的包被条件下，以2.00%BSA为封闭液处理1 h所得的空白检测值最低，因此，选择质量分数2.00%的BSA作为封闭液。

图2 封闭液的优化

2.3 适体及互补链浓度的优化

在已包被好SA的酶标板孔加入Bio-Aptamers，Bio-Aptamers与SA结合，再加入Bio-HRP和剩余的位点结合，因此450 nm处的吸光度随着Bio-Aptamers浓度的增加而降低，当吸光度趋于平衡时，即Bio-Aptamers结合量已达到饱和，此时的浓度为试验的最优适体浓度。如图3a所示，当适体浓度为270 nmol/L时，吸光度已趋于稳定，溶液颜色也无明显差异，因此,适体的最佳浓度为270 nmol/L。

图3 适体及互补链浓度优化

在适体优化的基础上，对Bio-DNA1的浓度进行优化。加入Bio-DNA1与已固定在酶标板上的适体互补结合，加入SA-HRP显色。Bio-DNA1结合的越多，吸光度越大，颜色也就越明显。当Bio-DNA1的添加量达到10 nmol/L时，样品的吸光度达到最大并保持稳定(图3b)，表明与适体结合的Bio-DNA1量已达到饱和，因此Bio-DNA1的最佳浓度为10 nmol/L。同时对酶标板2上包被的Bio-DNA2浓度进行优化(图3c)。优化原理与Bio-Aptamers的选择优化一样，当吸光度随着浓度的增大而保持稳定时，表明Bio-DNA2与SA的结合位点达到饱和。因此，选择Bio-DNA2的最优浓度为90 nmol/L。

2.4 标准曲线的建立及特异性研究

在最优试验条件下，考察酶联适体竞争法对不同质量浓度ZEA的响应情况。ZEA和适体发生特异性结合，导致酶标板1中的DNA1链从适体链上解离，与酶标板2中包被的DNA2链互补结合，并通过生物素-亲和素作用被HRP标记。随着ZEA适体质量浓度的增大，解离的DNA1链越多，被DNA2链捕获的HRP标记DNA1链也越多，导致反应体系的D(450)逐渐增大，溶液颜色逐渐加深。由图4可知，在0.5～100 ng/mL范围内，ZEA的质量浓度与反应体系的吸光度呈良好的线性关系，回归方程为y=0.004 3x+2.497 6(R2=0.995 9)，由LOD=3SD/S(LOD为检出限，SD为空白样品均值标准偏差，S为线性回归方程斜率)计算可得，该方法的检出限为0.44 ng/mL，可满足ZEA的检测需求。

图4 ZEA质量浓度与反应体系D(450)的关系

为考察该方法的特异性，分别以常与ZEA共存的AFB1、OTA和DON等几种真菌毒素为目标物进行检测。在最优试验条件下，采用酶联适体法对50 ng/mL ZEA、OTA、AFB1和DON的检测结果如图5所示，加入OTA、AFB1和DON后样品的D(450)与空白值基本一致，两者之间的差值接近于0；而加入ZEA后反应体系的D(450)明显增大。该结果充分表明酶联适体法检测ZEA具有良好的特异性。

图5 特异性分析

2.5 实际样品检测

分别采用本研究中建立的酶联适体法和市售ELISA试剂盒对加标量为50、100 ng/mL的玉米和玉米油样品进行检测，计算样品的加标回收率和相对标准偏差(RSD)。由表1可知，本研究建立的方法测定实际样品的加标回收率和标准偏差与ELISA法测定的结果基本相同，表明该方法具有和ELISA法相同的检测灵敏度和重复性，可用于食品中ZEA的检测。

表1 谷物制品中ZEA的检测回收率(n=6)

3 结论

以核酸适体为识别元件，构建了基于酶联适体竞争法检测ZEA的快速检测新方法。在最优试验条件下，反应体系中ZEA质量浓度与吸光度在0.5～100 ng/mL范围内具有良好的线性关系，方法的检出限为0.44 ng/mL。该方法具有灵敏度高、操作简便、检测成本低、结果可视化、样品处理简便等特点，可用于食品中ZEA的快速筛查和现场检测。此外，该方法具有通用性，可进一步拓展至食品中其他真菌毒素的检测应用中。