LRRK2调节纹状体神经元多巴胺受体1含量及机制

杨 璇 刘小鹏 彭 宇 甄 然 宋彬彬 李 阔 于 佳

富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)突变是PD最为常见的遗传因素，LRRK2突变所致的PD发病年龄晚，在临床表现上与特发性PD更为接近[1]。因此，对LRRK2生理病理功能机制的解释对于阐释帕金森病发病机制至关重要。LRRK2表达异常可导致小鼠运动功能障碍，但是其中的具体机制目前仍不明确[2]。本实验将利用LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突变基因敲入小鼠和R1441C突变基因敲入小鼠，明确LRRK2的表达或功能异常对纹状体神经元多巴胺受体1(dopamine receptor 1，D1R)含量的影响，并探讨LRRK2调节纹状体神经元中D1R的机制，为丰富人们对LRRK2参与帕金森病发病机制的认识提供理论依据。

材料与方法

1.实验动物：LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突变基因敲入小鼠和R1441C突变基因敲入小鼠及野生型对照组，饲养在美国国立卫生院老年病研究所，根据实验动物相关管理规定进行操作和处理[3～5]。

2.主要试剂：大鼠单克隆D1R抗体购自美国Sigma公司，兔单克隆抗体NeuN购自英国Abcam公司，山羊多克隆组织蛋白酶D(cathepsin D)抗体购自美国R&D Systems公司，驴血清购自美国Jackson Immuno Research公司，牛血清白蛋白购自美国Sigma公司，荧光二抗、抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)购自美国Invitrogen公司。

3.免疫荧光染色：小鼠进行腹腔麻醉，沿胸旁正中线切开皮肤、剪断肋骨、暴露心脏。在心尖处剪开左心室，插入灌流针至左心室，剪开右心耳。先用PBS灌流，冲净血液后用4%多聚甲醛固定液灌流。取脑后继续固定过夜，再放入30%蔗糖溶液中进行脱水。沿鼠脑冠状面做冰冻切片，厚度为40μm，将切片浸泡于PBS置于4℃保存。配制PBST(含0.3% Triton X-100)缓冲液，用封闭液(含10%驴血清和1%牛血清白蛋白的PBST)孵育脑片1h，然后4℃一抗孵育过夜，清洗3遍；荧光二抗室温下孵育脑片1h，PBS清洗3遍。将脑片铺展于载玻片上，并用抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)封片，晾干后，在激光共聚焦显微镜(LSM 800，德国Zeiss公司)下观察拍照。

结 果

LRRK2基因敲除或G2019S和R1441突变导致纹状体中多巴胺受体D1R含量下降(图1)。本实验利用LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠，应用免疫荧光染色的方法检测了12月龄小鼠纹状体中D1R表达情况。结果发现，LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体中D1R荧光强度均显著下降。

LRRK2通过调节溶酶体影响纹状体神经元多巴胺受体D1R含量(图2)。笔者利用cathepsin D免疫荧光染色标记溶酶体。观察发现，在12月龄野生型小鼠纹状体神经元内cathepsin D阳性的点状结构数目较少，而在12月龄LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内cathepsin D阳性点状结构数目显著增加，在LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内cathepsin D阳性点状结构直径增大。且经定量分析，在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内溶酶体所占据的总面积显著增加。同时笔者还发现，在野生型小鼠、LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中cathepsin D与D1R共定位，也就表明在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元溶酶体中D1R增加。

图2 12月龄野生型、LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中D1R和溶酶体标志物cathepsin D共定位情况

讨 论

目前已经证实了超过40个与PD发病相关的LRRK2突变，目前研究最多的突变位点有9个，分别是位于ROC结构域的R1441C、R1441G、R1441H、R1514Q突变[6]。位于COR结构域的Y1699C突变，位于激酶结构域的I2012T、G2019S突变以及位于WD40结构域的G2385R突变[7，8]。

研究者建立了多个LRRK2转基因小鼠模型以研究LRRK2在神经系统中的功能。Melrose等[9]建立了过表达野生型LRRK2或G2019S突变的转基因小鼠模型，并利用HPLC法检测发现野生型或G2019S转基因小鼠纹状体内多巴胺含量与非转基因小鼠比较无明显的改变，但是利用微透析法检测发现野生型或G2019S转基因小鼠纹状体细胞外多巴胺含量明显降低。Chen等[10]研究发现，12～16月龄的G2019S转基因小鼠表现为明显的运动障碍，而L-DOPA能够有效地改善该运动障碍。Maekawa等[11]利用HPLC法检测到在10周龄的I2020T突变转基因小鼠纹状体内多巴胺以及其代谢物DOPAC和HVA的含量均显著下降，且变现为明显的运动功能障碍。以上证据表明，LRRK2与多巴胺神经传递以及小鼠神经运动功能密切相关。

多巴胺受体D1R与帕金森病的关系已被人们广泛研究。多巴胺与多巴胺受体D1R结合，诱发胞内信号通路发生改变，从而介导多巴胺调控的神经运动功能[12]。其中最为经典的就是cAMP/PKA信号通路。D1R通过和Gαs偶联激活腺苷酸环化酶，促使细胞内cAMP合成增加，从而激活PKA并磷酸化多个底物蛋白。PKA能够导致多个离子通道蛋白磷酸化状态发生改变，如AMPA、GABAA、NMDA以及L、N和P型钙离子通道，影响谷氨酸以及GABA等神经递质的释放，从而调节运动功能[13]。

Rassu等[14]研究发现，过表达野生型和突变型(G2019S和R1441C)LRRK2的SH-SY5Y细胞膜上的D1R含量明显升高。但这一实验主要是在细胞系中进行，且仅检测了外源性D1R含量的改变，而未检测小鼠脑内D1R含量。在本实验中，笔者检测发现LRRK2表达缺失或G2019S和R1441突变均可导致纹状体中多巴胺受体D1R含量下调，据此可以推断LRRK2可调节纹状体神经元中D1R的含量。而LRRK2是通过何种细胞生物通路影响D1R的含量这一科学问题尚未明确。有研究表明，LRRK2可以通过调节Rab7的活性影响次级内体的功能，进而影响细胞降解功能[15]。

本研究中笔者利用cathepsin D免疫荧光染色标记溶酶体，结果发现12月龄LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内溶酶体数目均显著增加，在LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内溶酶体直径增大。且经定量分析，在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内溶酶体所占据的总面积显著增加，这一结果表明LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内的蛋白降解过程显著增强。同时，LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内与cathepsin D共定位的D1R也显著增加，表明在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内发生降解的D1R增加。

综上所述，本实验发现，LRRK2表达缺失或LRRK2 G2019S和R1441C突变均导致小鼠纹状体中D1R含量下降，明确了LRRK2表达缺失或基因突变所致功能异常可以影响纹状体中D1R的含量。LRRK2表达缺失、LRRK2 G2019S和R1441C突变可能通过促进小鼠纹状体神经元蛋白降解，促使进入溶酶体的D1R增加，D1R降解加强，从而使得纹状体神经元D1R含量下降。本研究结果有利于人们深入理解LRRK2的病理生理功能，并为LRRK2参与的帕金森病病理过程提供潜在的干预靶点。