微生物菌剂拌土对玉米茎基腐病的预防和促生效果

沙月霞 邢敏 李明洋 王晨曦 王佳娟 沈瑞清

摘要 為研发用于宁夏玉米茎基腐病预防的微生物菌剂。温室条件下检测了3株芽孢杆菌对玉米茎基腐病的预防和促生效果，研究了3株菌的相容性，田间试验验证了复合微生物菌剂拌土对宁夏玉米茎基腐病的预防与促生效果。温室试验结果表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HR15、萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）HR37和贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）HR55对宁夏玉米茎基腐病具有较明显的预防效果和促生长作用;相容性试验结果表明3株芽孢杆菌之间不存在相互抑制作用。田间试验结果证实微生物菌剂M1对宁夏玉米茎基腐病的预防效果达60%以上;微生物菌剂M2在乳熟期的预防效果为58.31%，蜡熟期达65.10%。2种复合微生物菌剂在乳熟期的防效与噁霉灵可湿性粉剂无显著差异，与微生物菌剂对照的防效之间有显著差异。微生物菌剂M1和M2明显促进玉米的出苗率和株高，对出苗率的促生效果与噁霉灵可湿性粉剂无显著差异。微生物菌剂M1和M2处理组的玉米产量高于噁霉灵可湿性粉剂与微生物菌剂对照处理组，有效增加有效穗数、千粒重、穗行数、行粒数、穗粒数，明显降低玉米秃尖长度。微生物菌剂M1和M2可以有效预防宁夏玉米茎基腐病，为粮食安全和玉米可持续发展提供技术支撑。

关键词 微生物菌剂;拌土;宁夏玉米茎基腐病;预防效果;促生效果

中图分类号 S432.1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）04-0141-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.039

Preventive and Promoting Efficacy of Microbial Agents Mixed with Soil against the Maize Stem Basal Rot in Ningxia

SHA Yue-xia， XING Min， LI Ming-yang et al

（Institute of Plant Protection， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan，  Ningxia 750011）

Abstract The research aimed to develop microbial agents against maize stem basal rot in Ningxia. The preventive and promoting efficacy of three Bacillus strains against maize stem basal rot under greenhouse condition was detected. The microbiological stand-off culture method was used to study the compatibility of three biocontrol bacteria. Field experiments were carried out to verify the impact on the prevention and growth promotion of compound microbial agents mixed with soil against the maize stem basal rot in Ningxia. B. subtilis HR15， B. atrophaeus HR37 and B. velezensis HR55 showed evident efficacy to prevent the maize stem basal rot and promote growing under greenhouse condition. The compatibility test showed that there was no mutual inhibition among three Bacillus strains. The results of field trial verified that the prevention efficacy of microbial agent M1 for the control of the maize stem basal rot in Ningxia reached more than 60%. The preventive efficacy of microbial agent M2 in the milk-ripe stage and dough stage were 58.31%and 65.10%， respectively. At the milk-ripe stage， there was no significant difference for the prevention efficacy between two compound microbial agents and xanthomycin wettable powder，  and there was significant difference between the prevention efficacy of two compound microbial agents and microbial agent control. The yield per unit area of microbial agents M1 and M2 were evident higher than xanthomycin wettable powder control and microbial agent control. In addition， the microbial agents M1 and M2 control effectively increased number of productive ear，1 000-kernel weight， ear rows， line grain number， grain number per spike， and reduced the length of corn bald tip obviously.

Key words Microbial agent; Mixed with soil;Maize stem base rot in Ningxia;Prevention effect;Promotion effect

基金项目 国家重点研发专项（2017YFD0201606）;宁夏回族自治区重点研发计划项目（2018BBF02018-06）。

作者简介 沙月霞（1974—），女，宁夏平罗人，副研究员，博士，从事植物病害生物防治及微生态学研究。通信作者，研究员，博士，从事植物病害综合防治技术研究。

收稿日期 2020-06-22

玉米莖基腐病是由多种病原菌复合侵染引起的典型土传病害，是危害世界玉米生产的主要病害之一。一般产量损失在10%～25%，严重年份可达75%。抗性品种、化学种衣剂和增施钾肥是目前生产上的主要措施，但品种选育时间较长，化学种衣剂的残留易污染生态环境，也会威胁人类健康，加重土壤的盐渍化，病原菌易产生抗药性。降低土壤中的病原菌数量与干扰其生长的土壤微生态环境是防治玉米茎基腐病的关键手段。因此，研发用于玉米茎基腐病的微生物菌剂对于粮食安全和玉米产业可持续发展具有重要的科学意义和应用价值。

研究表明，土壤中存活着多种病原菌，病原菌的数量与活性影响土壤微生物群落结构的稳定，进而影响农作物土传病害的发生[1-2]。因此，土壤微生物生态环境的不平衡会导致农作物土传病害的危害[3-4]。近年来，微生物菌剂被广泛用于改善土壤微生物环境，促进作物生长。芽孢杆菌（Bacillus）[5]、木霉菌（Trichoderma）[6]和假单孢菌（Pseudomonas）[7]3类微生物均对作物的生长起到促进作用。吕宁等[8]研究发现枯草芽孢杆菌可湿性粉剂滴施后对棉花黄萎病防治效果明显，土壤真菌、细菌和放线菌的数量与物种丰度随着施药量的增加而显著增加。Chen等[9]和吴晓儒等[10]采用木霉菌颗粒剂在播种前与化肥混合施入土壤，对玉米茎腐病防效显著。

目前微生物菌剂防治玉米茎基腐病的研究主要集中于拮抗菌的筛选[11]、药效评价[12]、生防机理的检测分析等[13]，而微生物菌剂拌土对玉米茎基腐病的预防和促生作用研究较少。枯草芽孢杆菌（B.subtilis）HR15、萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）HR37和贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）HR55是笔者所在课题组分离，对多种镰刀菌（Fusarium）具有明显的拮抗作用。笔者将3种菌株研制成复合微生物菌剂，在宁夏玉米茎基腐病常年发生的种植地区开展微生物菌剂拌土预防玉米茎基腐病的田间试验，探寻复合微生物菌剂施用对宁夏玉米茎基腐病的预防和促生作用，为进一步研究微生物菌剂施用后玉米田土壤的微生态功能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

2019年在宁夏回族自治区惠农区庙台乡东永固村进行田间试验。土壤类型为潮土，地下水位较高，盐碱较重，有机质平均含量为（16.70±3.77）g/kg，碱解氮平均含量为（84.9±24.4）mg/kg，有机磷平均含量为（26.7±17.3）mg/kg，速效钾平均含量（199.9±66.9）mg/kg。

1.2 试验材料

试验菌株为生防菌包括枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55。对照药剂：噁霉灵可湿性粉剂+生根粉，由深圳诺普信农化股份有限公司生产;微生物菌剂对照药剂MCK，其功能菌是枯草芽孢杆菌和酵素菌BYM（由细菌、放线菌和真菌三大类30多种有益菌和生物酶组成的功能团），枯草芽孢杆菌≥1亿个芽孢/g，酵菌素≥5亿/g，由雷邦斯生物技术（北京）有限公司生产，载体是水溶性腐殖酸≥55%。

温室玉米品种为丹玉三号，田间种植玉米品种为济玉901。

1.3 试验设计

温室试验设计6个处理：CK是玉米茎基腐病病土对照;HR15是枯草芽孢杆菌HR15发酵液;HR37是萎缩芽孢杆菌HR37发酵液;HR55是贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液;ES是噁霉灵可湿性粉剂+生根粉;MCK是微生物菌剂对照。

田间试验设计5个处理：CK是空白对照处理;M1是微生物菌剂M1;M2是微生物菌剂M2;ES是噁霉灵可湿性粉剂+生根粉;MCK是微生物菌剂对照。

1.4 供试菌株预防玉米茎基腐病的温室试验

低温保存的枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55梯度划线接种在NA培养基平板上37 ℃培养48 h，单菌落接种到LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养48 h获得发酵培养液。发酵液（1×108 CFU/mL）浸泡玉米种子丹玉三号（种子带菌）1 h，化学农药对照采用噁霉灵可湿性粉剂+生根粉浸种，空白对照采用无菌水浸泡，然后催芽24 h。将1 L发酵液与玉米茎基腐病常年发病较重的农田土壤以1∶3拌土处理，对照处理组不施用供试菌剂。每个花盆装2/3的试验土。催芽后的不同处理种子播种于相应处理的花盆中。种植玉米品种丹玉3号，每个花盆3粒玉米种子，每个处理10个花盆。播种30 d后调查玉米出苗率、测量株高;60 d后调查玉米茎基腐病的危害。

1.5 拮抗菌之间的相容性

参考Barbosa等[14]的测定方法，在LB固体培养基平板上一半划线接种一种功能菌株，同时在其另一半垂直划线接种另一种功能菌株，每个处理重复3次。将平板放置在30 ℃的生化培养箱中培养，24 h后观察和记录2个菌株之间的相容性反应。2个菌株之间不产生抑菌条带的为相容，反之为不相容。

1.6 微生物菌剂的制备

将活化24 h的枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55单菌落分别接种到装有液体NA培养基的种子发酵罐中，30 ℃、180 r/min振荡培养12 h。分别将3种菌株种子发酵液按照6%的比例转移到批量发酵罐中，30 ℃、180 r/min振荡培养48 h。培养好的3种菌液按照1∶1∶1的比例混合均匀。复合微生物菌剂主要由以下成分组成：枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55作为功能菌制备的微生物混合菌剂15 L、腐殖酸2.75 kg、硫酸钙160 g[15]、硫酸锌80 g[16]、硫酸亚铁80 g、硫酸钾80 g[17]，载体分别为羊粪（M1）和鸡粪有机肥（M2）约30 kg，鸡粪有机肥包含有机碳25.5%、氮1.63%、磷1.54%、钾0.85%，以上组分混合均匀，研制成复合微生物菌剂，低温保存。

1.7 微生物菌剂拌土的田间效果评价

在宁夏回族自治区惠农区庙台乡永固4队种植济玉901，种植前将微生物菌剂M1、M2和微生物对照药剂均匀撒施在农田土壤表面（600 kg/hm2），20%噁霉灵可湿性粉剂+生根粉（4～6 g/m2）喷施，然后用旋耕机旋耕（深度为20 cm左右），将微生物菌剂与土壤均匀混合。每个试验小区面积是200 m2，小区随机排列，每个处理4个重复。试验期间不施用其他杀菌剂，正常进行农艺措施和水肥管理。

在玉米乳熟期和蜡熟期分别调查玉米茎基腐病的发病率和病情指数，发病率以有無病斑为主。玉米苗期调查出苗率，并测量株高，拔节期测量茎基部第一节部位的周长。收获期调查结穗率和有效穗数，采集成熟玉米穗，测量玉米穗长、鲜重、秃头、穗粒数、行粒数、穗粗（穗中部位置的周长），评价微生物菌剂M1和M2对玉米的促产效果。

玉米茎基腐病调查方法按《农药田间药效试验准则》，玉米茎基腐病分级标准（植株个体受害程度）：1级全株生长正常，中下部叶片出现青枯/青黄枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常;3级全株叶片出现青枯症状，茎基生长正常，果穗生长正常;5级全株叶片出现典型青枯症状，茎基部变色且稍有水浸状，果穗基本正常;7级植株叶片出现典型青枯症状，茎基部明显变软但不倒状，果穗下垂，籽粒不饱满;9级全株枯死且倒伏，茎基部维管束破裂，籽粒干瘪。

计算公式：防效=[（空白对照区病株率-处理区病株率）/空白对照区发病率]×100%;发病率=[Σ（每个病级的植株数×相对级数值）/（调查总植株数×最高级数值）]×100%。

1.8 数据分析

运用Excel 2016进行数据统计，使用DPS15.0 软件进行统计分析，显著性分析采用单因素方差分析中的最小极差法（least significant ranges，LSD）（P<0.05），数据为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 供试菌株对玉米茎基腐病的预防效果

枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55发酵液在温室盆栽条件下对丹玉3号玉米茎基腐病的防效见表1。由表1可知，3株菌的防效达69%以上，其中贝莱斯芽孢杆菌HR55的防效最高，与噁霉灵可湿性粉剂处理组无显著差异（P>005）;枯草芽孢杆菌HR15处理组和微生物菌剂对照处理之间无显著差异（P>0.05），萎缩芽孢杆菌HR37的温室防效与这2组处理差异较小。

2.2 供试菌株在温室条件下对玉米的促生效果

枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55在温室盆栽条件下对丹玉3号玉米促生效果见表2。由表2可知，3株供试菌株在温室条件下，对玉米的出苗率和株高促进效果显著，其中贝莱斯芽孢杆菌HR55对株高的促进率最高，萎缩芽孢杆菌HR37对出苗率的促进效果最明显。3株供试菌株的促生效果与微生物对照药剂、化学农药对照无显著差异（P<005）。

2.3 供试菌株之间的相容性

图1显示枯草芽孢杆菌HR15、萎缩芽孢杆菌HR37和贝莱斯芽孢杆菌HR55之间具有良好的相容性，菌株之间不相互抑制，可以混合使用。

2.4 微生物菌剂拌土对玉米茎基腐病的田间预防效果

微生物菌剂M1和M2拌土对宁夏玉米茎基腐病的田间防效见表3。由表3可知，5组处理在玉米乳熟期防效差异较大，微生物菌剂M1的防效最高，与噁霉灵可湿性粉剂具有显著差异（P<0.05），M2的防效与微生物菌剂CK无显著差异（P>005）;5组处理在玉米蜡熟期的防效差异较大，微生物菌剂M2和微生物菌剂CK、噁霉灵可湿性粉剂无显著差异（P>0.05）。

2.5 微生物菌剂拌土对玉米的田间促生效果

微生物菌剂M1和M2拌土对玉米的出苗率和株高的促生作用见表4。由表4可知，2种微生物菌剂对玉米出苗率的促生作用无显著差异（P>0.05），与噁霉灵可湿性粉剂处理组也无显著差异（P>0.05），与微生物菌剂对照有显著差异（P<0.05）。2种微生物菌剂对玉米株高的促生作用也无显著差异（P>0.05），与噁霉灵可湿性粉剂、微生物菌剂对照有显著差异（P<0.05）。

2.6 微生物菌剂拌土对玉米的增产效果

微生物菌剂M1和M2拌土对玉米的增产效果见表5。由表5可知，2种微生物菌剂在有效穗数、穗长、穗重、秃尖、穗行数、行粒数、单粒重、千粒重和产量方面增产效果良好。其中微生物菌剂M2产量比空白对照CK增产效果达52.10%，比噁霉灵可湿性粉剂拌土处理组增产4 160.1 kg/hm2;微生物菌剂M1产量比空白对照CK产量增产率达36.96%，比噁霉灵可湿性粉剂拌土处理组增产2 701.35 kg/hm2。2种微生物菌剂处理组千粒重与噁霉灵可湿性粉剂处理组无显著差异（P>0.05）。微生物菌剂M2的玉米穗最长，显著增加单个玉米穗重、穗行数、行粒数，对玉米秃尖的降低率达45.77%。微生物菌剂M1处理组玉米穗最粗，单个玉米粒最重。微生物菌剂对照在有效穗数、秃尖、穗行数、行粒数、单粒重和千粒重方面具有较明显的增产效果，但在穗长和穗重方面小于空白对照。

3 结论与讨论

玉米是重要的粮食作物，随着全球气候条件的变化、重茬连作、高密度栽培等，玉米农田生态环境随之改变，土壤中病原菌的优势菌群结构发生改变，病残体的积累数量越来越大，有益微生物群落结构和数量也发生较大变化。这些因素导致玉米田土壤微生物群落结构失衡，玉米土传病害的发生日趋严重[18]。玉米茎腐病的病原菌很复杂，受地理环境及气候条件影响较大。许大凤等[19]研究发现安徽省凤阳县玉米茎基腐病的病原菌主要是禾谷镰孢菌（F.graminearum）、串珠镰孢菌（F.verticillioides）、尖孢镰孢菌（F.axysporum）、层出镰孢菌（F.proliferatum）和木贼镰孢菌（F.equiseti），禾谷镰孢菌和串珠镰孢菌的分离频率分别为47.05%和26.47%。崔凌霄等[20]研究发现甘肃省玉米茎基腐病的病原菌为藤仓镰孢霉菌（F.fujikuroi）。宁夏玉米茎基腐病发生地区仅分离到了镰刀菌。

土壤是生态系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤微生物在土壤形成和发育、土壤有机质转化、土壤生态系统平衡、土壤环境净化与生物修复等方面起着重要作用[21-22]。因此，微生物菌剂拌土后在一定程度会影响土壤微生物的生态功能和整个生态系统，进而直接或者间接影响地上植株的健康状况[23]。土壤微生物之间存在着错综复杂的互利互惠或者相互抑制的关系。生物农药的主要成分是抗菌活性物质，施入土壤之后，抗菌活性物质抑制了病原菌的数量和活性，增加了有益微生物的数量与活性[24]，进而引起了一些物种丰度的增加或者降低，从而间接影响了地上植株的生长发育和抗病性以及抗逆性[25]。研究表明，微生物菌剂可以广泛改善土壤微生物环境，接种微生物菌剂能够改善土壤结构和营养状况，调节土壤酶的活性，提高土壤肥力和养分利用率。程凯等[26]采用拮抗菌ZJ6 和ZJ1 与氨基酸生物有机肥混配后施入棉花农田土壤中，土壤细菌和防线菌数量显著下降，土壤真菌数量显著增加，而土壤中病原菌的数量下降了98.2%，棉花黄萎病的危害显著降低。付健[27]研究发现木霉菌施药后能够显著改变盐碱地玉米非根际和根际土壤微生物群落结构，提高土壤中有益细菌的丰度，降低土壤病原菌的丰度，增加具有促生作用的真菌丰度，土壤有机质含量增加。该研究中的微生物菌剂M1和M2拌土，有效预防了宁夏玉米茎基腐病的危害，显著促进了玉米的出苗率和株高，提高了产量、有效穗数、单粒重，并降低玉米穗部的秃尖率。

在实际生产中，可以采用微生物菌剂拌土处理，并结合种子包衣或拌种的方式增强玉米植株免疫力抵抗土壤中植物病原菌的侵染。该研究研发的复合微生物菌剂M1和M2可以有效预防宁夏玉米茎基腐病，在玉米产业可持续发展中具有重要的应用价值。

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