EZH2、IMP3、Glut1蛋白在恶性间皮瘤组织中的表达及意义

(1 青岛大学基础医学院病理学系，山东 青岛 266003； 2 单县中心医院病理科； 3 青岛大学附属医院病理科)

恶性间皮瘤(MM)是一种罕见的间皮源性恶性肿瘤，因组织形态多样，其诊断及与转移性腺癌、反应性间皮细胞增生(RMH)的鉴别诊断存在困难，尤其与RMH的鉴别更是一个挑战。目前用于两者辅助鉴别诊断的免疫组织化学抗体对其诊断特异度及灵敏度均不高[1]。zeste基因增强子人类同源物 2(EZH2)是新发现的具有组蛋白甲基转移酶活性的肿瘤相关蛋白，参与细胞的周期调控、衰老、分化以及肿瘤发生等病理生理过程，该蛋白的异常表达可促进肿瘤的发展和转移[2-3]。胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白3(IMP3)作为一种新识别的mRNA结合蛋白，参与调节胰岛素样生长因子Ⅱ的转录，影响胚胎组织增殖，其高表达与多种恶性肿瘤患者预后不良相关，而阴性或弱表达被认为是良性或低级别病变[4-6]。临床研究发现，葡萄糖转运蛋白1(Glut1)作为哺乳动物细胞葡萄糖转运的主要载体，为肿瘤细胞摄取葡萄糖提供跨膜转运，其在肿瘤细胞中表达的强弱或与肿瘤的恶性程度相关[7-8]。为验证上述论断，本文采用免疫组化方法检测EZH2、IMP3、Glut1蛋白在MM和RMH组织中的表达状况，探讨其在MM的诊断及预后判断中的意义。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集单县中心医院2013-2018年经病理诊断为MM的蜡块标本50例，诊断和分类均按照《恶性间皮瘤病理诊断指南》[9]标准执行。所有病例均由两位经验丰富的高年资诊断医师双盲法阅片复诊。本组病例男17例，女33例；年龄39～76岁，平均60岁；发生于胸膜18例，腹膜 32例；组织学形态呈上皮型29例，肉瘤型10例，双相型11例；40例患者有石棉接触史。所有患者术前均未行放化疗或免疫治疗。同时选取20例RMH样本作为对照组，其中男13例，女7例；年龄42～74岁，平均59岁。

1.2 主要试剂

兔多克隆抗体EZH2购自英国Abcam公司，兔抗人IMP3单克隆抗体(克隆号EP286)、鼠抗人Glut1单克隆抗体(克隆号SPM498)及二抗试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 研究方法及判定标准

所有标本经石蜡包埋，常规4 μm厚切片，分别行HE染色和免疫组织化学SP法染色。以PBS液替代一抗作为阴性对照，用已知的EZH2阳性的乳腺癌组织、IMP3阳性的胰腺癌组织及Glut1阳性的胎盘组织作为阳性对照。综合分析每张切片中细胞的染色强度及阳性细胞百分比，对染色强度及阳性细胞百分比评分，两项指标分数乘积>3分为阳性表达[10]。

1.4 随访

通过电话联系及调阅电子病历进行随访，随访截至2020年5月，患者生存期从最初诊断截至死亡，以月为单位计算。

2 结 果

2.1 EZH2、IMP3、Glut1在MM及RMH组织中的表达情况

EZH2阳性表达定位于细胞核中，部分伴细胞质着色，以淋巴细胞作为阳性内对照，50例MM中(图1A～C)阳性表达率为88%，20例RMH中(图1D)阳性表达率为10%，EZH2在MM与RMH组织中的表达差异有显著性(χ2=35.19，P<0.05)。IMP3定位于细胞膜及细胞质中，以淋巴细胞作为阳性内对照，50例MM中(图1E～G)阳性表达率为60%，而20例RMH中(图1H)阳性表达率为5%，IMP3在MM与RMH中的表达差异具有显著意义(χ2=15.36，P<0.05)。Glut1定位于细胞膜，以组织内红细胞作为阳性内对照，Glut1在50例MM中(图1I～K)阳性表达率为68%，20例RMH(图1L)中均未见阳性表达，Glut1在MM与RMH组织中的表达差异有显著性(χ2=26.46，P<0.05)。

2.2 EZH2、IMP3、Glut1及联合检测对MM诊断的价值

研究结果示，EZH2并IMP3、EZH2并Glut1、IMP3并Glut1、EZH2并IMP3并Glut1对MM诊断的灵敏度分别为90%、98%、84%、98%。其他见表1。

表1 EZH2、IMP3、Glut1联合检测对MM诊断的价值

2.3 EZH2、IMP3、Glut1表达与MM患者临床病理学特征的关系

IMP3表达与MM患者发病部位有关(χ2=5.22，P<0.05)，而与其他各项临床病理参数无关(P>0.05)；EZH2、Glut1表达与MM患者临床病理学参数无关(P>0.05)。见表2。

2.4 EZH2、IMP3、Glut1表达与MM患者预后的关系

本组50例MM患者随访资料完整，随访率100%。截至随访，50例患者均死于该疾病。1年总生存率为26%，两年总生存率为2%。IMP3阳性表达的患者平均生存时间为9个月，1年总生存率为20%，阴性表达者平均生存时间为12个月，1年总生存率为50%，IMP3阳性表达者生存率较阴性表达者显著降低，差异有显著意义(χ2=10.35，P<0.05)；EZH2及Glut1阳性表达者与阴性表达者生存率比较差异均无显著性(P>0.05)。

A～C：EZH2在上皮样、肉瘤样及双相型MM组织中均阳性表达；D：EZH2在RMH组织中失表达；E～G：IMP3在上皮样、肉瘤样及双相型MM组织中均阳性表达；H：IMP3在RMH组织中失表达；I～K：Glut1在上皮样、肉瘤样及双相型MM组织中均阳性表达；L：Glut1在RMH组织中失表达。SP法，100倍

表2 EZH2、IMP3、Glut1表达与MM患者临床病理特征的关系

3 讨 论

MM是源于浆膜腔被覆的间皮细胞的恶性肿瘤，其形态学复杂，需要与RMH、转移癌等多种良恶性病变进行鉴别诊断，尽管RMH与MM在大部分情况下区别是明显的，但是在穿刺活检组织较少或组织学不典型的情况下，单从形态上很难区分是增生还是肿瘤，因此除常规形态学特征外，联合应用多种生物标记可用于两者的诊断和鉴别诊断[11-14]。有研究认为Desmin和EMA是最常应用的免疫标记物[15]，然而，这些标记物对MM诊断的灵敏度与特异度均低于90%，在日常临床实践中作用有限。最近，有研究提示EZH2、IMP3及Glut1在MM中过表达，而在RMH中低表达或不表达，因此，预测它们在临床病理诊断上可能具有一定的应用价值，为了验证这一推测，本研究对50例MM中EZH2、IMP3及Glut1的表达及其意义进行了初步探索。

EZH2是PcG基因家族的核心成员，在表观遗传沉默以及细胞周期中发挥着重要作用。EZH2通过靶向催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27m3)从而沉默与细胞分化、抑制增殖在内的基因，导致肿瘤的发生[16-17]，并与肿瘤的恶性进展、侵袭性及转移能力关系密切[18]。目前，已在多种恶性肿瘤中证实EZH2蛋白过表达，而在对应的正常组织中不表达或低表达[19-20]。此外，过表达与肿瘤的增殖和患者的预后差密切相关[21]。高胜男等[22]研究了67例MM中EZH2的表达情况，结果显示诊断的灵敏度为77.6%。有研究显示EZH2高表达对MM诊断具有比较高的特异度，可与RMH进行鉴别[23]。本研究中EZH2诊断MM的灵敏度为88%，特异度为90%，在MM中阳性表达率显著高于RMH，提示EZH2在MM与RMH的鉴别诊断中有一定的应用价值。

IMP3是胰岛素样因子RNA结合蛋白家族中的一员，调节胰岛素样生长因子Ⅱ转录，在胚胎发生早期的RNA定位和稳定以及细胞生长中起着重要的作用[24]。IMP3也是癌胚蛋白，有研究报道其表达与多种恶性肿瘤相关，如胰腺癌、肾癌、肺癌及胃癌等，而在正常细胞、反应性增生细胞和良性肿瘤细胞中通常呈阴性表达[25-26]，表明IMP3是区分恶性肿瘤与良性病变的重要生物标记物。有研究应用免疫组化法检测45例MM中IMP3的表达，结果显示33(73%)例呈阳性表达，而64例RMH中均无表达[27]。本研究50例MM中有30例呈阳性表达(60%)，20例RMH中仅1例呈阳性表达(5%)，本研究结果显示IMP3是区分MM与RMH的重要提示标志物。进一步分析显示IMP3表达与患者发病部位有关，发生于腹膜者IMP3表达多于发生于胸膜者，可能与本组患者腹膜发病者(腹膜/胸膜比为1.8∶1)比例高有关，而其表达与患者年龄、性别、组织分型、石棉接触史等均无关。Kaplan-Meier法分析显示IMP3表达与患者的总生存期有关，提示IMP3是影响MM预后的重要因素。

Glut1是葡萄糖转运蛋白家族的成员，促进葡萄糖进入细胞，广泛表达于正常人的红细胞、胎盘的滋养叶细胞和合体滋养叶细胞、血脑屏障的内皮细胞中，而在其他正常组织中不表达。但当细胞增生活跃、转化或恶变时，细胞膜葡萄糖摄取和转运增加，可导致Glut1异常高表达[28]。据报道在包括子宫内膜癌、胃癌以及肾细胞癌等多种恶性上皮性肿瘤中均有Glut1的过表达[29]。研究发现，Glut1在RMH患者中的阳性表达率为13.8%，在MM中为88.0%[1]。本研究结果显示，Glut1对MM诊断的灵敏度与特异度分别为68%、100%，说明Glut1是一种有效的免疫组织化学标记物，可用于MM与RMH的鉴别诊断。

本研究首次采用了免疫组化的方法联合检测EZH2、IMP3及Glut1在MM和RMH组织中的表达。在50例MM中EZH2、IMP3及Glut1的阳性表达率均高于20例RMH，其中EZH2的阳性表达率最高(88%)，但也有10%的RMH患者阳性表达EZH2。本文结果还显示，Glut1对MM的诊断特异度为100%，但其诊断灵敏度在3个抗体中最低，仅为68%。因此，我们认为单独检测3种抗体对MM及RMH的鉴别诊断价值有限，但联合检测EZH2、IMP3及Glut1，尤其是EZH2以及Glut1联合检测对诊断MM的灵敏度以及特异度可分别达到98%、90%，对MM和RMH的鉴别诊断具有较高应用价值。

综上所述，MM和RMH的鉴别诊断要结合临床、组织形态学特点和免疫组化检测结果等综合判断，同时联合检测EZH2、IMP3及Glut1 3种抗体对MM的准确诊断和患者预后判断有重要价值。