精养池模式下不同生长速度花鳗鲡的肠道菌群比较研究

王 悦 赵盼月 陈学豪，2 翟少伟，2*

（1.集美大学水产学院，鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建厦门361021；2.福建省水产生物育种与健康养殖工程研究中心，福建厦门361021）

花鳗鲡（Anguilla marmorata）是属于鳗鲡目（An⁃guilliformes）、鳗鲡科（Anguillidae）的降海洄游性鱼类，在全球的热带、亚热带西太平洋和印度洋海域均有广泛分布，在我国主要分布于东南沿海及台湾省[1-2]。近年来由于日本鳗鲡（Anguilla japonica）和欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）鳗苗的过度捕捞和环境问题导致天然捕捞量逐渐减少，价格急剧攀升[1，3]。而花鳗鲡在世界范围分布较广，其鳗苗价格较为便宜，在我国东南部地区具有一定的养殖规模[1,4]。

肠道是鱼类消化饲料和营养物质吸收的主要部位，具有特殊的微生物群，肠道菌群对鱼类的生长和健康起着重要作用，其组成与鱼体生长速度密切相关，生长速度快的个体可能拥有更多的肠道益生菌[5-8]。通过比较不同生长速度的鱼类肠道菌群的组成，可为肠道原籍益生菌的筛选提供参考。研究表明，原籍益生菌比一般的益生菌更容易在鱼类的肠道内定植，在维持肠道健康，包括促进宿主的生长，产生消化酶和必需营养素，抵抗病原体的感染，刺激先天免疫系统等方面的作用更强[8-9]。花鳗鲡在实验室循环水养殖条件下的快速生长个体肠道内拥有更多的益生菌[6]，而其在实际生产条件下不同生长速度个体间的肠道微生物差异情况还未见报道。因此，本研究旨在比较分析花鳗鲡主要的养殖模式——水泥池精养（精养池）条件下不同生长速度个体肠道菌群的差异，为肠道原籍益生菌的筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验所用花鳗鲡取自福建龙岩大泉鳗鱼养殖有限公司养殖场的方形水泥精养池中（面积为324 m2、水深1 m），养殖时间为12 个月。按鱼体重量分为三组，即缓慢生长组（SG）、中速生长组（MG）和快速生长组（FG），不同组花鳗鲡平均重量分别为（83.65±9.60）g/尾、（216.98±19.97）g/尾和（386.73±51.90）g/尾；每组6个重复。

1.2 试验饲料与饲养管理

试验期间投喂福建天马科技集团股份有限公司生产的黑仔鳗粉状饲料，主要营养成分为：粗蛋白47.90%、粗脂肪6.34%、粗灰分12.12%、水分6.56%、钙2.77%、总磷1.9%。每天6：00和18：00饱食投喂，投喂时在饲料中加入鱼油（饲料干重的3%），并按料水比1∶1的比例混匀后搅拌成团状，置于投料台供鳗鱼摄食。试验期间精养池水温24～30 ℃，pH值6.0～7.5，溶解氧浓度8～12 mg/L，亚硝酸盐浓度0.15～0.22 mg/L，每天排出污水2次，每次换水量约为50 m3/池。

1.3 样品采集

取花鳗鲡肠道样品前禁食24 h，将其置于MS-222麻醉剂溶液中浸泡10～15 min，接着用75%乙醇冲洗鱼体表面，然后用无菌剪刀和镊子将肠道从腹腔中分离出来，用PBS 缓冲液冲洗，清除干净肠道内容物。最后将每尾鱼的中肠黏膜样品置于1.5 mL 无菌离心管中。不同体重花鳗鲡的肠道样品分别标记为SG组（样品编号A1～A6），MG组（样品编号A7～A12），FG 组（样品编号A13～A18）。所有样品保存于-80 ℃冰箱中直到提取DNA。

1.4 DNA的提取和肠道菌群生物信息学分析

按照Fast DNA™SPIN（MP Biomedical，USA）试剂盒的说明书进行所有样品肠道微生物DNA 的提取，之后再利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的DNA，检验合格的样品委托北京奥维森基因科技有限公司利用Illumina MiSeq 平台进行16S rDNA高通量测序，并对测序得到的数据进行生物信息学分析。具体步骤与检测分析过程与Shi等[7]的研究一致。

1.5 数据统计与分析

测序得到的原始数据经过进一步的过滤得到有效数据，对有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类，默认按照0.97 的相似度进行OUT 聚类分析。利用QIIME version v.1.8 平台分析菌群的α多样性，分析指标包括Shannon 指数、Chao1指数和覆盖度（coverage）。使用LEfSe 软件分析组间相对丰度具有统计学意义的差异菌，设置LDA Score 筛选值为3.0，P＜0.05。

2 结果

2.1 肠道菌群多样性分析（见图1、表1）

图1 所有样品的肠道菌群稀释曲线

由图1 的稀释曲线可知，各样品曲线已趋于平坦，表明测序数据量合理，测序深度可靠。

表1 不同生长速度花鳗鲡肠道菌群的多样性

由表1可知，FG组的OUTs、Shannon指数高于MG组和SG 组，MG 组的Chao1 指数高于FG 组和SG。各组的覆盖度均接近1.00，表明该测序深度已基本覆盖样品所有物种。

2.2 不同组花鳗鲡肠道菌群在门水平上的组成差异（见图2）

由图2可知，不同组花鳗鲡肠道菌群在门水平上主要以梭杆菌门（Fusobacteria）和厚壁菌门（Fir⁃micutes）为主，其中MG 组和FG 组这2 个门所占比例在75%以上。在门水平上，FG 组梭杆菌门的相对丰度高于SG 组和MG 组，MG 组厚壁菌门的相对丰度高于FG 和SG 组，SG 组放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度高于FG和MG组。

图2 不同组花鳗鲡肠道菌群在门水平上组成的差异

2.3 基于属水平的肠道菌群LEfSe分析（见图3）

图3 基于属水平花鳗鲡肠道菌群LEfSe分析

图3 的LEfSe 分析显示，FG 组慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和不动杆菌属（Acinetobacter）的相对丰度显著增加（P＜0.05），MG 组Iamia、固氮弧菌属（Azoarcus）和厌氧黏细菌属（Anaeromyxobacter）的相对丰度显著增加（P＜0.05），SG组拟杆菌属（Bacteroides）、代尔夫特菌属（Delftia）和水栖菌属（Enhydrobacter）等细菌的相对丰度显著增加（P＜0.05）。

3 讨论

正常鱼类的肠道中存在大量的微生物菌群，肠道菌群结构受发育阶段、营养水平、饮食、季节、温度和地理位置等多种因素的影响[6-10]。在微生物学研究中，Shannon 指数是用来衡量微生物种类多样性的指标，OTUs 和Chao1 指数通常用来估计物种总数，代表生态系统中细菌种类的丰富程度[6-7]。本研究发现FG组肠道菌群的Shannon指数高于SG组，说明快速生长的花鳗鲡肠道可能具有较高的微生物多样性，与不同生长速度花鳗鲡肠道菌群变化的结果一致[6]。MG组的Chao1 指数在三组中最高，与不同生长速度欧洲鳗鲡肠道菌群变化的结果相同[7]，说明中速生长的花鳗鲡肠道中菌群丰度高于生长缓慢的花鳗鲡。各组覆盖度均在99%以上，表示样本未被测量的概率较低[11]。

本研究中，花鳗鲡肠道内的优势菌门有梭杆菌门和厚壁菌门，其中梭杆菌门在FG组相对丰度最高，成为快速生长花鳗鲡的优势菌门，这与之前在花鳗鲡、欧洲鳗鲡中的研究结果相似[6-7]。梭杆菌是一种厌氧的革兰氏阴性菌，能够产生丁酸盐等短链脂肪酸，被认为是淡水鱼类肠道菌群的优势菌[7，12]。MG 组厚壁菌门的相对丰度最高，在不同生长速度大黄鱼（Pseu⁃dosciaena crocea）肠道菌群结构的研究中也有类似结果[10]。研究表明，厚壁菌门能够刺激鱼类肠道内脂肪酸的吸收和代谢，促进宿主对能量的吸收和储存[13]。属于厚壁菌门的乳酸菌属（lactobacillus）通常被认为是与健康的肠道上皮相关的有益微生物[7]。因此，相对丰度较高的梭杆菌门和厚壁菌门可能对花鳗鲡的生长产生有益作用。此外，放线菌门和拟杆菌门在生长缓慢的花鳗鲡中相对丰度较高，与缓慢生长组花鳗鲡肠道菌群中的研究结果相似[3]。有研究发现，缓慢生长的大黄鱼肠道内放线菌门的含量低于正常生长的大黄鱼，而拟杆菌门的含量则高于正常生长的大黄鱼[10]。郁维娜等[14]通过对健康和患病凡纳滨对虾（Litopenaeus van⁃namei）肠道菌群分析，发现患病对虾中拟杆菌门丰度较高而放线菌门丰度较低。这种差异的产生可能与水生动物的物种、遗传背景及环境等因素有关[15]。

在属水平上花鳗鲡肠道菌群LEfSe 分析结果显示，FG组花鳗鲡肠道内，不动杆菌属和慢生根瘤菌属的相对丰度显著增加。研究表明，不动杆菌是一种曾经从鱼类肠道中分离出来的革兰氏阴性菌，是花鳗鲡、日本鳗鲡肠道的优势菌群[8,16]。Huang等[11]在不同阶段欧洲鳗鲡肠道菌群组成的研究中，发现不动杆菌在欧洲鳗鲡的幼鳗肠道中占有一定比例，而在其他生长阶段均未检测到。不动杆菌属还是银鲫（Carassius aura⁃tusgibelio）、青鱼（Mylopharyngodon piceus）、鳙（Para⁃bramis pekinensis）等淡水鱼中的优势菌属，可有效预防病原菌感染，产生消化酶，并且有产生抑制鳗弧菌的物质的能力[8,17]。此外，在健康黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）[18]、投喂益生菌后军曹鱼（Rachycentron can⁃adum）[19]，以及许氏平鲉（Sebastes schlegelii）仔鱼、稚鱼、幼鱼[20]肠道中不动杆菌是最优势菌属。但有一些研究发现不动杆菌属中的鲁氏不动杆菌和鲍氏不动杆菌为养殖鳗鲡的致病菌，可能导致细菌性疾病的发生[21-22]。在本研究采集花鳗鲡肠道样品过程中，未发现肠道异常现象。由于本试验中的16S rDNA测序未能对种水平细菌进行鉴定，还不能确定肠道内是否存有鲁氏不动杆菌或鲍氏不动杆菌，这一点还有待于进一步研究。考虑到快速生长花鳗鲡肠道中不动杆菌属丰度的变化情况，我们认为不动杆菌属中的一些细菌很可能是原籍益生菌，这与Hsu等[8]认为不动杆菌可能为益生菌的结论一致。慢生根瘤菌是一种对固氮有重要作用的革兰氏阴性菌，在日本鳗鲡[8]、牙鲆（Paralich⁃thys olivaceus）[23]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[24]和斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[25]等鱼类的肠道中均有发现，但是其功能还未见报道。

Iamia 是一种需氧型革兰氏阳性菌，曾在鳙[17]和凡纳滨对虾[26]的肠道中被发现，在其他水生动物中还鲜见报道。固氮弧菌被认为能够减少罗非鱼（Oreo⁃chromis niloticus）养殖池塘中的含氮废物污染，而厌氧黏细菌则存在于尼罗罗非鱼养殖池塘的底泥中，具有降解有机质和生态修复功能[27-28]。这两种菌的代谢可能会影响池塘中的物质循环，从而影响养殖鱼类的健康状况，但并未在其他鱼类的肠道中发现，其在花鳗鲡肠道中的功能还有待进一步研究。SG 组拟杆菌属、代尔夫特菌属和水栖菌属的相对丰度显著增加，与不同生长速度花鳗鲡肠道菌群的研究结果不同，可能是养殖环境不同造成的差异[6]。拟杆菌属是一种厌氧的革兰氏阴性菌，淡水鱼类肠道中的主要菌属之一[8]。有研究表明，拟杆菌与宿主的关系有益生性和致病性两方面，一方面对机体健康有利，能够释放抗炎物质来维持免疫系统的平衡，另一方面对机体有促炎作用，诱导结肠炎和胃炎的发生[29-30]。在本研究中，拟杆菌可能在花鳗鲡肠道中诱导肠炎发生进而造成其生长缓慢。代尔夫特菌属是一种严格好氧菌，其丰度在缓慢生长组斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肠道中较快速生长组高[5]，与本试验结果一致。另外，代尔夫特菌属在牙鲆[23]、欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）[31]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[32]和大西洋鲑（Salmo salar）[33]肠道中均有发现，但其主要功能尚未报道。水栖菌属属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），弧菌科（Vib⁃rionaceae），是存在于日本鳗鲡肠道的常见菌群，也是水产养殖动物常见的病原菌[16,34]，其相对丰度的增加与花鳗鲡生长的关系还需进一步的研究。

4 结论

精养池条件下不同生长速度的花鳗鲡肠道菌群结构存在差异，快速生长个体肠道菌群多样性较高；一些不动杆菌属细菌可能是其肠道中潜在的益生菌。