4种獐牙菜属植物的快速鉴别研究

缪明锦，黎氏文梅，赵飞亚，陶爱恩*

（1. 大理州食品药品检验所，云南 大理 671000；2. 大理大学药学院，云南 大理 671000；3. 云南大学旅游文化学院医学院，云南 丽江 674199）

0 引言

青叶胆为龙胆科獐牙菜属植物Svuertia mileensis T.N. Ho et W. L._Shih的干燥全草，具有退黄、除湿、舒肝健胃的功效[1]。在藏医药中作为治疗肝炎、黄疸型肝炎、肝脏疾病的药物[2]。主要含有环烯醚萜、三萜、生物碱等化学成分[3]，具有保肝、降血糖、抗菌及抗病毒等活性[3-4]。随着近年来市场需求不断增加，原料药远不能满足市场需求。而且青叶胆野生资源的匮乏，且尚无人工种植，市场上出现了许多混伪品，常见为丽江獐牙菜、川西獐牙菜、大籽獐牙菜等，导致青叶胆临床用药的安全性和有效性得不到保证，严重干扰了药材市场的正常运行，而且对中成药生产造成极大干扰，因此有必要对青叶胆药材及其混伪品进行快速鉴别。已有学者报道獐牙菜属植物DNA鉴别[5]、UPLC指纹图谱[6]、遗传多样性[7]，但尚未见红外光谱结合多元统计学在青叶胆及其丽江獐牙菜、川西獐牙菜、大籽獐牙菜等混伪品的快速鉴别研究。鉴于此，本研究采用经典的形态鉴别和红外光谱鉴别手段，探讨青叶胆及其混伪品的异同，以期建立一种快速、准确高效的青叶胆真伪鉴定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Nexus傅里叶变换红外光谱仪(美国热点尼高丽公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；FW-4A型粉末压片机(天津市拓普仪器有限公司)。

1.2 材料

样品采集于云南大理、弥勒，经大理大学药学院夏从龙教授鉴定为青叶胆Swertia mileensis T. N. Ho et W. L._Shih、丽江獐牙菜Swertia delavayi、大籽獐牙菜Swertia macrosperma(C. B. Clarke) C. B. Clarke、川西獐牙菜Swertia mussotii Franch.，样品信息见表1。

表1 样品信息

2 方法

2.1 原植物形态分析

4种獐牙菜属原植物见图1，比较茎、叶及花的特征。

2.2 供试品的制备

34批药材干燥至恒重，粉碎过80目筛，备用。按照课题组前期方法制备供试品和数据处理分析[8]。

3 结果与分析

3.1 4种獐牙菜的形态鉴别

图1 4种獐牙菜原植物图

4种獐牙菜的植物形态特征见图1。《中国华人民共和国药典》(2015年版)收载的正品青叶胆茎呈四棱形，棱上具狭翅，花冠淡蓝色，下部具两个腺窝，腺窝杯状，仅顶端具短柔毛状流苏。与其比较，丽江獐牙菜茎呈圆形，花冠黄绿色，基部有一圈紫晕，基部具1个腺窝，腺窝马蹄形，有2个黑紫色斑点；大籽獐牙菜茎四棱形，花冠黄绿色，中部以上具黄绿色花纹，下部具一个腺窝，半圆形，上半部边缘具短流苏；川西獐牙菜茎四棱形，棱上具狭翅，花冠暗紫红色，基部两个腺窝，腺窝距圆形，边缘具长柔毛状流苏。

3.2 4种獐牙菜的平均红外光谱对比分析

4种獐牙菜的平均红外光谱图见图2，主要吸收区域为900～400cm-1，1310～900cm-1，1500～1310cm-1，1800～1500cm-1，2800～3000cm-1，3000～3500cm-1附近，吸收峰主要集中在1800～500cm-1的范围内，3000～3500cm-1波段宽而大的吸收峰为O-H伸缩振动[9]；2800～3000cm-1为烷烃C-H的伸缩振动1800～1500cm-1波段主要表征苯环的碳骨架弯曲振动以及C≡N，C=O、C=C等伸缩振动；1310～900cm-1波段为单键的伸缩振动区和部分含氢基团的弯曲振动；1500～1310cm-1主要代表了C-H的弯曲振动；900～400cm-1波段主要为烯的碳氢弯曲振动，苯环弯曲振动和面外弯曲振动等。从图2的Ⅰ区中可以看出青叶胆与其混伪品比较出现向上的锯齿吸收峰差异明显，表明不同种之间整体化学成分存在差异。

图2 4种獐牙菜的平均红外图谱

3.3 4种獐牙菜的二阶导数红外光谱对比分析

对红外光谱进行二阶导数处理，可以提高谱图的分辨率[10]。对4种獐牙菜的红外光谱进行二阶导数求导，结果见图3。从图中可以看出，4种獐牙菜的主要鉴别区域为Ⅱ区(1000～900cm-1波段)和Ⅲ区(800～500cm-1波段)，在Ⅱ区，青叶胆、圈纹獐牙菜、显脉獐牙菜有3个向上的“锯齿”，而紫红獐牙菜明显有4个向上的“锯齿”，在Ⅲ区，4种獐牙菜向上的“锯齿”吸收峰数目均不同。进一步表明，青叶胆与其混伪品之间化学成分不同，丽江獐牙菜、大籽獐牙菜、川西獐牙菜能否替代青叶胆入药，尚需研究。

图3 4种獐牙菜的二阶导数谱图

3.4 PCA和PLS-DA分析

本研究对34批獐牙菜药材的红外光谱数据进行二阶求导等预处，导入SIMCA-P13.0进行PCA和PLS-DA分析。在PCA得分图中(图4-a)，青叶胆单独聚为一类，聚类效果较好；川西獐牙菜、丽江獐牙菜和大籽獐牙菜距离很近，但能明显区分。在PLS-DA二维得分图中(图4-b)，青叶胆单独聚为一类，川西獐牙菜、丽江獐牙菜和大籽獐牙菜聚为一大类，PLS-DA聚类结果优于PCA分析。PCA和PLS-DA均能把青叶胆及其混伪品鉴别。

3.5 HCA分析

本研究对34批獐牙菜药材的红外光谱数据进行坐标归一化、二阶求导等预处，导入SPSS 22.0得到数据矩阵，应用Ward聚类法进行系统分析[14]，如图5。可以看出，距离为25时，4种獐牙菜可聚为1类，在距离系数为20处，4种獐牙菜聚为2类，青叶胆单独聚为一类，川西獐牙菜，丽江獐牙菜，大籽獐牙菜聚为一类。在距离系数为5处，大籽獐牙菜单独聚为一类，江獐牙菜与川西獐牙菜距离较近，但也能分开，HCA的聚类效果与PCA和PLS-DA分析结果一致。

4 讨论

图4 4种獐牙菜的PCA（a）和PLS-DA（b）二维得分图

本研究采用形态鉴别和红外光谱探讨4种獐牙菜属植物形态和整体化学成的差异。形态特征结果表明，与正品青叶胆比较，其余3种獐牙菜形态特征存在明显差异，可作为青叶胆及其混伪品的形态鉴别依据。红外结果表明，4种獐牙菜平均图谱1500～500cm-1波段，二阶导数图谱1000～900cm-1和800～500cm-1波段内差异较大，PCA、PLS-DA、HCA均能将青叶胆与其混伪品区分，表明4种獐牙菜整体化学成分差异较大，红外光谱可作为青叶胆及其混伪品化学鉴别依据。青叶胆属于2015年版《中国药典》收载的正品药材，主要分布于云南弥勒，资源濒危严重，川西獐牙菜在藏药中有记载用于治疗肝炎、黄疸型肝炎、肝胆疾病[2]，丽江獐牙菜具有治疗病毒性肝炎[15]，大籽獐牙菜具有保肝作用[16-18]，但通过形态和整体的化学成分分析，4种獐牙菜差异较大，丽江獐牙菜、大籽獐牙菜和川西獐牙菜能否替代青叶胆入药还需进一步研究。本研究采用形态结合红外光谱可对青叶胆及其混伪品快速鉴别，为青叶胆质量评价提供一种科学方法。

图5 4种獐牙菜的HCA图