HIF-1α抑制剂在白血病治疗中的研究进展

张月仙,陈 亨,沈云峰

0 引言

骨髓微环境为低氧状态,低氧是影响造血干细胞和白血病细胞生物学的关键微环境因素。1992年Wang等[1]在研究缺氧诱导的红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的基因表达时，发现一种蛋白质,能与EPO基因3′端增强子的寡核苷酸序列特异性结合,并促进EPO的转录,首次将这种蛋白质命名为缺氧诱导因子-1(HIF-1)。

HIF-1主要由HIF-1α和HIF-1β 2个亚基组成。HIF-1α是唯一的氧气调节亚单位,可通过刺激葡萄糖转运蛋白、糖酵解酶和糖酵解诱导因子的表达,调节从氧化应激反应到糖酵解的代谢[2]。HIF-1α在正常组织和癌细胞中都是缺氧反应的重要调节因子,低氧时可与HIF-1β结合,调控多种低氧反应性基因的转录与表达。HIF-1α在肝癌、肺癌、骨肉瘤、胶质瘤、卵巢癌、肾细胞癌等多种肿瘤组织中过度表达,并调节其生物学行为,包括新生血管生成、肿瘤细胞的新陈代谢、肿瘤干细胞的免疫逃逸等。而在白血病微环境中,各种异常均表明存在HIF-1反应,如VEGF、CXCL12、SCF的分泌增加,以及缺氧程度和酸度的增加。Bonnet、Rouault-Pierre等[3-4]研究证实,急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的骨髓在白血病晚期阶段高度缺氧,且所有患者确诊时均有HIF-1α过表达,当达到细胞遗传学缓解时,HIF-1α染色阳性率显著降低。此外,Wang等[5]为了探讨HIF-1α和VEGF-A基因在AML中的作用,收集了57例AML患者和17例正常人外周血和骨髓标本,结果显示,急性髓系白血病(AML)患者HIF-1α和VEGF-A的表达均高于正常对照组,且HIF-1α与VEGF-A呈正相关,认为这与白血病细胞的生长有关,可能成为一个很有前途的治疗靶点。Kontos等[6]发现,HIF-1α mRNA高表达的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的总体生存率较低,其表达状态指导预后的意义可独立于临床分期和其他预后指标,因此,HIF-1α过表达可作为CLL预后不良的独立分子标志物。Abdul-Aziz等[7]发现,缺氧可导致骨髓中AML细胞的转移抑制因子(Migration inhibitory factor,MIF)高表达,且表达水平高于外周血或脾脏。结果表明,在缺氧条件下,沉默HIF-1α可抑制MIF的转录调控,从而提高AML模型的存活率,表明缺氧/HIF-1α/MIF轴在促进AML肿瘤存活和增殖方面的重要作用。

近期研究表明,HIF-1通路的激活在白血病的进展、治疗和预后中发挥着重要作用。因此,抑制HIF-1α的表达成为延缓疾病进展、治疗白血病的新思路。目前,针对HIF-1α抑制剂的研究,多集中于实体瘤领域,而白血病方面较为少见。本文总结了近年来在白血病领域研究较多的几种HIF-1α抑制剂及其在白血病中的研究进展。

1 HIF-1的功能结构及基因调控

1.1 HIF-1的结构 HIF-1以异源二聚体的形式存在,主要由HIF-1α和HIF-1β 2个亚基组成。HIF-1α为HIF-1特有,是活性亚基,决定了HIF-1的稳定性和活性;HIF-1β是组成性亚基,又称为芳烃受体核转位蛋白(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)。HIF-1α和HIF-1β亚基均为bHLH/PAS家族的成员,包含bHLH结构域(Basic helix-loop-helix,bHLH)、PAS结构域(Per-ARNT-Sim,PAS)、反式转录激活结构域(Transcriptional activation domain,TAD)、氧依赖性降解结构域(Oxygen-dependent degradation domain,ODD区)等结构。

1.2 HIF-1的降解和稳定性 常氧条件下,在细胞浆内,氧感受器辅氨酰羟化酶(Prolyl hydroxylases,PHDs)羟化HIF-1α亚基ODD区辅氨酸,使HIF-1α与VHL蛋白(Von hippel-lindau protein,pVHL)结合形成复合物。pVHL是泛素连接酶的成分之一,可引导HIF-1α进入泛素-蛋白酶体途径降解。而在缺氧条件下,由于氧分子减少,PHDs的作用受到抑制,阻止了HIF-1α的泛素降解途径,导致HIF-1α降解速度减慢,引起HIF-1α在细胞核内积聚并转录激活。HIF-1α的转录激活过程相对复杂,此过程的调控因子包括:P300/CBP、CITED2、MAPK、HSP90、SRC家族等,这些因子相互作用,协同调节HIF-1。

1.3 HIF-1对下游靶基因的调控 HIF-1α转录激活以后在细胞核内聚集,并与核内的HIF-1β结合形成有活性的HIF-1复合物,与其调节的下游靶基因的缺氧反应元件(Hypoxia response element,HRE)结合,形成转录起始复合物启动靶基因的转录。HRE是HIF-1靶基因的启动子或增强子内所共有的一段基因序列,又称反式作用DNA序列,为HIF-1α的DNA结合位点。目前,已有超过70个基因被HIF-1调控,这些下游靶基因被激活后,可促进肿瘤血管生成、细胞增殖,保证肿瘤的能量代谢,最终加速肿瘤转移和耐药性的出现。

2 HIF-1α抑制剂

2.1 棘霉素 棘霉素(Echinomycin)是喹噁啉家族的一员,通过2个扁平状的喹喔啉环插入到DNA分子的碱基对之间,从而抑制了DNA的复制、转录和RNA合成[8]。临床前研究证实,棘霉素在肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、恶性肉瘤等疾病中具有抗肿瘤活性。棘霉素的靶序列包括缺氧反应元件序列,从而使棘霉素成为有效的HIF-1α抑制剂。

2.2 BAY 87-2243 BAY 87-2243是选择性HIF-1α抑制剂,主要是通过抑制线粒体复合体I来抑制线粒体活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的产生,进而降低HIF-1活性。BAY 87-2243的活性依赖于PHDs和VHL蛋白,因此，PHDs-VHL-蛋白酶体轴在HIF-1α蛋白降解中具有重要作用。

2.3 EZN-2208 伊立替康是拓扑异构酶I抑制剂,SN-38是伊立替康的活性代谢物,其溶解性差,不适合作为治疗剂,研究者将聚乙二醇附着在SN-38上开发出了EZN-2208。与伊立替康相比,EZN-2208的半衰期更长,溶解性更好,药代动力学更优,不良反应更少[9]。目前,EZN-2208在晚期成人实体瘤、儿童复发性或难治性实体肿瘤中具有临床耐受性,主要的不良反应包括腹泻、脱水、骨髓抑制、发热性中性粒细胞减少、恶心和疲劳等[10-11]。EZN-2208还可诱导下调肿瘤中的HIF-1α及其下游靶基因(如MMP2、VEGF、GLUT1、GLUT3等)的mRNA水平,具有更强的抗增殖、抗凋亡和抗血管生成作用。

2.4 吖啶黄素 吖啶黄素(Acriflavine,ACF)是一种FDA批准的具有HIF-1α抑制特性的小分子天然化合物,可抑制上皮细胞向间充质转化,激活p53导致细胞死亡,并诱导线粒体或内质网凋亡和自噬。ACF可抑制乳腺癌、骨肉瘤、肝细胞癌、结直肠癌和脑肿瘤等多种肿瘤的生长和进展。临床研究显示,长期服用ACF作为抗肿瘤药物，未发现重大不良反应[12-14]。

2.5 雷公藤甲素 雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是从雷公藤中提取的一种环氧二萜内酯化合物,具有抗炎及免疫抑制作用,主要用于自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎、肾病综合征、溃疡性结肠炎等。TPL可抑制肿瘤细胞的生长,包括急性髓系白血病、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和多种消化道肿瘤(如结肠癌、肝癌、胃癌和胰腺癌)等。

2.6 2-甲氧基雌二醇 2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME2)是一种天然存在的雌激素代谢物,作为一种抗癌剂已被广泛研究,在体内外对尤文肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、食管癌、肝细胞癌、卵巢癌、鼻咽癌、前列腺癌等肿瘤均有抑制生长和诱导凋亡的作用。2-ME2也具有抗白血病活性,其主要靶点为缺氧诱导因子,可抑制HIF-1α、微管和肿瘤血管生成,可能的作用机制包括细胞在G2/M期的聚集,抑制超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧的积累,增加p53和p21的表达,以及细胞色素的线粒体释放等[15]。2-ME2是一种耐受性良好的小分子药物,口服具有活性,优于其他化疗药物。

3 HIF-1α及其抑制剂在白血病方面的研究进展

3.1 CLL CLL是西方国家最常见的成人白血病,其特征是大量成熟的克隆性B淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏等中积聚。在CLL中,HIF-1α促进骨髓的新生血管生成,调节趋化因子受体和细胞黏附分子的表达,包括关键的归巢和迁移因子(如CXCR 4、CXCL 12等),从而维持CLL细胞在骨髓微环境内的存活[16]。

TP53异常的CLL患者对以氟达拉滨为基础的化疗方案具有固有的抵抗力。针对此问题,Griggio等[17]研究了BAY 87-22433在TP53异常的CLL细胞中的作用，结果显示,与TP53野生型细胞相比,TP53异常的CLL细胞HIF-1α的表达水平显著升高，转录活性更强,且BAY87-22433克服了TP53基因缺失的白血病细胞对氟达拉滨的耐药问题,与伊鲁替尼联合应用具有很强的协同细胞毒作用,还可显著减少骨髓中白血病细胞的浸润,增加白血病细胞凋亡的比例。这些证据表明,HIF-1α抑制剂可作为一种有前途的CLL治疗策略。

Valsecchi等[16-18]用EZN-2208治疗CLL,发现EZN-2208可明显抑制HIF-1α的表达,从而损害CLL细胞中CXCL 12因子的定向趋化作用,减少CLL细胞对基质的黏附和在脾脏及骨髓中的定植,并可诱导细胞死亡,延长小鼠存活时间。Valsecchi等[19]还发现,EZN-2208可增强CLL细胞对氟达拉滨诱导CLL细胞凋亡的敏感性,显示出明显的抗白血病活性。

3.2 慢性髓系白血病(CML) CML是一种以bcr-abl融合蛋白的存在为特征的骨髓增生性肿瘤。bcr-abl融合蛋白是一种活性酪氨酸激酶,可促进CML细胞的复制和存活,而HIF-1α在CML干细胞的存活和维持中起重要作用。Zhang等[20]研究HIF-1α在CML的发生和维持中的作用时发现,由于HIF-1α的缺乏,导致了白血病干细胞(Leukemia stem cells,LSC)中细胞周期抑制因子p16InK4a、p19Arf、p57以及凋亡基因p53的表达增加,因此,抑制HIF-1α通路可能有效根除白血病干细胞,为开发HIF-1α抑制剂治疗CML提供理论基础。

Cheloni等[21]的小鼠CML模型实验表明,ACF能减少白血病的发生及LSC维持,在体内外对非CML造血细胞的影响较小。ACF还可减轻小鼠的整体CML负担,表现为脾肿大程度减轻,骨髓、外周血和肺中的白血病细胞减少。因此,ACF成为抑制LSC、防止CML复发的一种可能治疗策略。Ng等[22]通过沉默HIF-1α基因,证明CML干细胞在缺氧条件下的维持是依赖HIF-1α的。CML细胞中的一些缺氧调节基因,尤其是广泛参与生存和细胞黏附的基因,也可能是CML干细胞的治疗靶点。因此,联合抗BCR-ABL1和抗HIF-1α治疗，在消除LSC和治愈CML方面前景广阔。

Chen等[23]探讨TPL在耐药髓系白血病细胞系中的作用时提到,TPL通过下调HIF-1α和Nrf2的表达,分别提高了耐药细胞株HL60和K562对阿霉素及伊马替尼的药物敏感性,提示TPL对上述2种耐药细胞株均具有高度毒性,且呈剂量依赖关系。当TPL联合这2种抗癌药物时,HIF-1α在mRNA和蛋白水平均下调,下游基因如BNIP3、VEGF和CAIX在mRNA水平下调,CXCR4在蛋白水平下调,提示TPL可明显影响HIF-1α及其下游靶基因的功能和表达。

此外,姜黄素作为一种印度香料,可通过阻止细胞转化、增殖和侵袭以及诱导细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。Monteleone等[24]采用SWATH-MS技术评价了亚毒性剂量姜黄素对K562细胞的作用。结果显示,姜黄素可诱导糖代谢相关蛋白持续减少,其中大部分是HIF-1α靶点,其影响代谢酶谱的机制与miR-22介导的IPO7表达下调导致HIF-1α活性降低有关。结果表明,miR-22/IPO7/HIF-1α轴可能是姜黄素的一个新的分子靶点,为更好地定义姜黄素的治疗活性和抗癌特性提供了新的见解。

3.3 ALL 在急性T淋巴细胞白血病中,HIF-1α促进Notch1信号激活,导致细胞增殖、侵袭和耐药。有关急性B淋巴细胞白血病中HIF-1因子作用的数据较少,目前已经证实的是HIF-1α由骨髓中的白血病B细胞表达[25]。

治疗急性T淋巴细胞白血病的化疗方法可有效减少肿瘤负荷,然而,由于白血病前干细胞的存在,使得疾病容易复发;由于其独特的低增殖状态,白血病前干细胞对现有化疗药物的敏感性较低。Gerby等[26]为鉴定靶向白血病前干细胞的化合物,通过高通量筛选的方法筛选出2-ME2,证实2-ME2可通过抑制Notch1下游效应分子MYC的翻译,阻止SCL/TAL1活性,从而消除白血病前干细胞的自我更新活性,但不影响MYC在正常的造血干祖细胞中的功能。此外,Zhang等[15]研究2-ME2在急性T淋巴细胞白血病的作用机制时发现,2-ME2可导致G2/M期细胞周期阻滞,引起急性T淋巴细胞白血病细胞出现典型的凋亡改变,还可通过上调p21蛋白、下调Bcl-2蛋白和下调功能失调的p53蛋白来诱导细胞凋亡。

3.4 AML AML是一种高度异质性疾病,由多种染色体畸变和调节髓系细胞分化及增殖的基因突变引起。Wang等[27]研究棘霉素在TP53突变的AML中的作用时发现,HIF-1α在突变的AML细胞中表达水平更高,与传统的化疗药物和放射疗法相比,棘霉素可选择性地消除CD34+CD38-AML肿瘤干细胞,对白血病和淋巴瘤具有显著的治疗效果。此外,在人AML异种模型中,采用棘霉素短期治疗可预防AML的连续移植。上述结果支持棘霉素优先针对AML干细胞的观点。

Zhe等[28]研究了2-ME2对于AML的生物活性,结果显示,在AML中,HIF-1α的表达随着2-ME2剂量的增加而降低,且VEGF、GLUT1和HO-1的表达也在转录水平受到抑制。此外,在相同浓度下,AML细胞对2-ME2的敏感性高于阿糖胞苷,而2-ME2对正常造血干细胞的作用弱于传统的化疗药物。

当前,维甲酸-三氧化二砷(ATRA-ATO)联合治疗是治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)的标准方案,治愈率较高,但目前出现了对砷剂的抗药性,而且携带PLZF-RARA融合蛋白的APL患者对维甲酸治疗存在部分抗药性。有报道,在APL中,沉默HIF-1α可延缓白血病进展,并与全反式维甲酸协同消除白血病干细胞[29]。因此,Coltella等[30]对EZN-2208进行研究,发现EZN-2208处理APL细胞后,HIF-1α靶基因的表达呈剂量依赖性下调,这些基因参与了关键的促癌功能,如癌症代谢、细胞迁移等,可抑制APL小鼠模型中白血病的进展,延长小鼠的存活时间。与ATRA联合使用时,EZN-2208在清除白血病和根除白血病干细胞方面具有协同作用。

4 总结

HIF-1α可以作为判断白血病预后的独立危险因素,也可作为抗白血病的重要靶点。目前,大多数缺氧诱导因子抑制剂已经在实体瘤中进行了研究,少量用于恶性血液病的临床前模型测试。虽然HIF-1α抑制剂在白血病中的研究处于早期阶段,但综合现有文献中关于缺氧诱导因子在白血病中作用和功能的分析,随着研究的逐步深入,HIF-1α抑制剂有望能为目前无法治愈或为一线治疗成功后复发的患者提供一个可靠的治疗选择。