基于整合药理学的当归抗动脉粥样硬化的作用机制研究

方欢乐,张 慧,陶炎炎,李瑶窈,陈衍斌

0 引言

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病发生的基础,其可导致冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性脑卒中等阻塞性血管疾病，威胁着人类健康。我国中医将AS的发病机制归结为气、血、津液紊乱,脏腑功能失调而形成痰证、瘀证等[1]。当归为伞形科植物当归[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]的干燥根,具有补血活血作用[2]。现有研究表明，当归活血化瘀作用可对血液系统产生抗动脉粥样硬化作用[3],但其作用机制及物质基础尚不明确。

中药整合药理学平台整合中药材数据、中药方剂数据、中药成分数据、中药靶标数据、疾病相关分子数据资源,采用人工智能、数据挖掘、网络计算及可视化等方法和技术,开展中药(含方剂)靶标预测及功能分析、 证候相关分子挖掘及功能分析等模块,可建立的“中药-成分-靶标-疾病”多维分析平台,从分子水平揭示中药药效物质与疾病作用关系,其研究路线见图1。本研究采用TCMIP V2.0(http://www.tcmip.cn),探究当归治疗动脉粥样硬化的活性成分及其可能的分子作用机制。

图1 网络药理学研究路线图

1 资料与方法

1.1 当归化学成分的筛选 在 TCMIP V2.0 的“中药材数据库”中,可得到关于当归药材的化学成分以及相关化学成分对应的靶标。

1.2 候选靶标来源及其靶标预测 在功能列表中药(含方剂)靶标预测及功能分析界面中,在疾病检索项下勾选“atherosclerosis” 构建其疾病靶标数据库。根据成药性等级,选择目标当归的化学成分库，依据成药性评价等级,根据成药性的优劣,选择相似性分数≥0.8的成分为当归候选靶标。对候选靶标进行基因功能挖掘,进一步开展富集分析。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用信息 通过 TCMIP的中医药关联网络挖掘资源提供的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)的数据库HAPPI、Reactome等，获得当归作用靶标与AS 疾病靶标之间的PPI信息。

1.4 网络构建及分析 选取中药-疾病相互作用网络的核心节点;通过计算网络节点的连接度(Degree)、介度(Betweenness)和紧密度(Closeness),筛选网络中的核心节点基因,构建“当归-动脉粥样硬化”相互作用网络,并通过网络拓扑特征计算及基因功能和通路的富集分析,构建“当归-化学成分-核心靶标-关键通路-疾病”的多层次关联网络,发现当归干预动脉粥样硬化疾病的物质基础及其作用机制。

1.5 基因功能和通路富集分析 通过 TCMIP的中医药关联网络挖掘资源如GO(Gene ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等数据库,对关键靶标的基因和通路富集分析(选择),P<0.05筛选差异有统计学意义的生物功能及过程,选取P值前20的关键通路信息。

2 结果

2.1 当归化学成分靶标预测及分析 通过TCMIP V2.0平台对当归化学成分的分析结果可知:共收集了当归64个化学成分，主要含有挥发油、有机酸、香豆素类、生物碱类、氨基酸、萜类等,预测当归的潜在靶标数量为677个。对当归潜在靶标进行基因功能分析和通路富集分析。选择P值前20的主要基因功能信息列于表1，即为当归候选靶标基因所参与的生物学功能信息,结果发现其功能多与细胞膜离子通道、GABA-A受体、电压门控钠离子通道、钠、氯离子通道、核受体、类固醇激素受体、氨基酸类神经递质(NMDA受体)、氧化还原酶活性等相关。同时对当归潜在药靶进行通路分析,所得分析结果中,选择P值前20的关键通路信息列于表2中,即为当归候选靶标参与通路的信息分析表,发现主要在神经递质的调节、核受体转录、碳水化合物代谢、能量代谢、脂类代谢、RNA生物合成、维甲酸循环病、RORA(维甲酸孤核受体A)基因的表达、PPARA基因的表达等涉及多个系统的疾病。现有实验研究显示，当归可产生保护心血管、镇痛、抗炎、抗氧化、平喘、调节平滑肌、抗肿瘤等作用[4],其对造血系统、循环系统、神经系统、免疫系统等多个系统产生的作用与当归候选靶标参与通路信息分析是一致的。

表1 当归候选靶标的功能信息

表2 当归候选靶标参与通路的信息

2.2 当归治疗动脉粥样硬化的核心靶标网络、基因功能和通路富集分析

2.2.1 核心靶标网络 通过整合分析的网络分析模块,基于PPI数据,构建当归潜在靶标与疾病靶标相互作用网络,见图2。图中共得到56个与AS及药物相关核心网络靶标。其中药物作用直接靶标23个,疾病直接靶标30个,疾病与药物间共有靶标3个。表1列举了degree排名前20的靶标，以疾病直接靶标为主的包括:ESR1、SCARB1、NR1H4、CEPT、PPARG、APOE、LCAT等。

药物作用靶点的主要来源是疾病靶点,由图2可知,当归与AS共有的3个靶标分别为PPARG 、MTTP、 PLA2G2A。其中PPARG是共有靶点,同时是网络中相互作用较高的靶点。PPARG主要负责脂类的分解代谢等,参与体内包括脂肪细胞的分化、炎症反应、动脉粥样硬化等病理生理过程。而AS的发病主要为脂质浸润、炎性反应。所以预测当归抗AS的靶点可能为PPARG。有报道，当归芍药散具有抗AS作用,其机制可能与促进其主动脉斑块内PPARG表达有关[5]。

图2 当归“药物作用靶标-动脉粥样硬化”相互作用网络

2.2.2 基因功能分析 通过GO和KEGG数据库的基因和功能分析,结果见表4、表5。当归的药物靶标和AS疾病靶标基因功能分析结果显示，当归通过参与核受体活性、类固醇激素受体、抑制及激活细胞外配体门控离子通道、GABA氯离子通道活性、结合胆固醇、胆汁、参与调节突触后膜氯离子电位、核受体转录辅酶活性、胆汁通道活性、与转录因子的结合、激活胆固醇通道、结合类固醇等多个相关条目改善AS。在通路富集中显示，当归对抗AS的可能通路有核受体转录途径、细胞类泛素化、高密度脂蛋白重塑、胆汁酸、胆汁盐的代谢,调节过氧化物酶体增殖活化受体α(PPARα)活性基因的表达及类固醇、乳糜微粒、白色脂肪细胞的含量,参与炎症因子信号通路及雌激素依赖基因的表达等。而现有实验研究表明，高密度脂蛋白(HDL)具有抗动脉粥样硬化作用。目前已经有人提出抑制胆固醇脂转运蛋白作为提高HDL水平的一种方法[6]。炎症因子也参与动脉粥样硬化炎症反应[7]。而PPARα作为核受体超家族的一员,可通过调节炎性细胞因子及表面黏附分子的表达等对抗动脉粥样硬化[8]。

表5 当归治疗动脉粥样硬化核心靶标通路富集分析

2.2.3 当归治疗动脉粥样硬化的“中药-成分-靶标-通路”多维网络分析 基于图2,采用网络拓扑特征计算与核心靶标基因功能及核心靶标通路的富集分析,建立当归治疗动脉粥样硬化的“中药-成分-靶标-通路”多维网络结果图,见图3。进一步分析当归干预动脉粥样硬化疾病的物质基础及其作用机制。

由图3可知,当归的核心靶标有26个,当归药材64种成分,其中17种有效成分直接或间接作用AS,直接作用的8种成分主要为有机酸类和挥发油类。软脂酸通过调节PPARα、CCL2、MMP9作用于IL-4及IL-13信号通路，对抗动脉粥样硬化性疾病。藁本内酯、东莨菪碱内酯通过MTTP、APOE作用干扰乳糜微粒作用,调节脂质代谢,对抗AS。

现有研究报道,血脂异常升高是动脉硬化引起心脑血管疾病的主要因素之一,当归挥发油具有一定的降脂及抗动脉粥样硬化作用[9],炎症反应是动脉硬化引起心脑血管疾病的主要因素之一[10],当归有机酸可通过降低炎症因子的表达,抑制炎症反应和脂质介导的动脉粥样硬化[11]。实验研究和网络研究结果一致。

图3 当归治疗动脉粥样硬化的“核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系

3 结论

AS的发病过程主要表现在动脉血管中胆固醇的大量积累和慢性炎症的产生,其目前发病机制有多种学说,包括脂质浸润、炎性反应、钙超负荷学说、氧化应激等[12]。在临床治疗AS 的过程中,中医药发挥了独有的优势,中医药具有全方位和多靶点的作用特征,通过辨证论治,根据证型进行方剂加减,能够对AS发生和发展的各个环节发生作用,临床效果显著。而且一些中药复方或单味药提取物一定程度上降低了心脑血管疾病的发病率[13]。

当归一直是国内外学者研究的热点,当归及含当归的复方制剂改善血液系统的作用广泛，如当归芍药散可治疗非酒精性脂肪性肝病[14],当归芍药散对缺血性脑卒中小鼠具有脑保护作用[15],当归补血汤治疗贫血的同时，具有抗动脉粥样硬化作用[16-17]。岷当归有效成分当归挥发油和阿魏酸能减轻模型兔血管内皮的损伤,对高同型半胱氨酸血症致兔 AS 病变有防治作用[18-19]。本研究通过中医药整合平台共筛选出当归的活性成分64 个,其中8种有效成分直接作用于AS。研究显示，当归的主要活性成分作用靶点主要包括炎症基因靶点PPARG、CCL2、MMP9及脂质基因靶点MTTP、APOE、LCAT等,主要涉及炎症反应、脂质代谢环节。这些研究也显示预测的机制与部分研究结果一致,具有较高的准确性。本研究是基于中药整合药理学平台所做的预测,具体的作用靶点及作用通路还需要实验加以验证。