LncRNA OIP5-AS1靶向miR-511-3p抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

张耀森 卢国杰 钟惠铃 高建伟 陈亚勇 胡瑞娟

肺癌是呼吸科常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率、高死亡率和5年预后较差等特点，其在世界癌症死亡率中位居第一［1］。尽管在肺癌治疗方面已经取得了进展，但是肺癌患者的5年预后生存率仍然未超过20%［2］。长链非编码RNA 显示在肺癌中起到抗癌或抑癌的效果，参与肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等，在临床诊断和治疗中具有潜在的意义［3］。研究发现，OIP5-AS1 在肺癌组织中表达上调，其异常表达与肿瘤大小、淋巴结转移和预后不良相关；敲低OIP5-AS1 能够抑制肺癌细胞的增殖，OIP5-AS1 通过调控miR-378a-3p 促进肺癌细胞的增殖［4］。miR-511-3p 在前列腺癌、结直肠癌等癌症中异常表达［5-6］。研究发现，miR-511-3p 在前列腺中组织和细胞中表达下调，可能与患者的总体生存期较短相关，过表达miR-511-3p 可以促进前列腺癌细胞的增殖和迁移［5］，但是在肺癌中的研究机制尚不明确。因此，本研究将探讨LncRNA OIP5-AS1 通过靶向调控miR-511-3p 对肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与结果

1.1 细胞和主要试剂

人正常肺上皮细胞BEAS-2B 和人肺癌细胞A549、NCI-H460、NCI-H2170 购自中国科学院上海细胞库；FBS、RPMI 1640 购自美国Gibco 公司；Lipofectamine 2000 试剂盒、Trziol 试剂盒和逆转录试剂盒购自美国Invitrogen 公司；青霉素、链霉素、MTT 试剂盒购自北京索莱宝公司；Transwell 小室、Matrigel 基质胶购自美国Corning 公司；CyclinD1抗体、MMP-2 抗体、GAPDH 抗体购自美国Abcam公司；双荧光素酶试剂盒美国Promega 公司；引物由上海吉玛公司设计合成。

1.2 细胞培养与转染

人正常肺上皮细胞BEAS-2B 和人肺癌细胞A549、和NCI-H460、NCI-H2170 置于5%CO2、37℃培养箱中培养，且培养基内含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基。细胞生长至85%时，加入胰酶消化传代培养。将对数生长期的肺癌细胞A549 在培养内稀释细胞，然后按照Lipofectamine 2000 试剂盒说明书将si-NC 组、si-OIP5-AS1 组、miR-NC 组、miR-511-3p组、pcDNA 组、si-OIP5-AS1+anti-miR-NC 组 和si-OIP5-AS1+anti-miR-511-3p 组，转染至A549 细胞中，转染6 h 后换新鲜培养基，继续培养48 h。

1.3 OIP5-AS1和miR-511-3p的表达

取1.2 各组的正常肺上皮细胞BEAS-2B 和人肺癌细胞A549、和NCI-H460、NCI-H2170，采用Trziol 试剂盒说明书提取总RNA，在分光光度计测定RNA 纯度和浓度，采用逆转录试剂盒合成cDNA，然后进行qRT-PCR 扩增，其中分别以GAPDH 和U6 作为内部内参。

1.4 MTT 检测细胞增殖

取1.2 各组肺癌细胞A549，加入0.25%胰酶消化细胞，然后将细胞稀释后接种至96 孔板内，细胞密度为2×103个/孔，培养时间至48、72 h 时，每孔内加入5 mg/mL MTT，培养4 h，培养液内加入DMSO，在酶标仪A490 纳米处检测细胞吸光度值。

1.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移实验：取1.2 各组肺癌细胞A549，采用不含血清的RPMI1640 培养基将细胞密度调整为1×105个/mL。然后在Transwell 下层小室加入400 μL 含10% FBS 的RPMI 1640 培 养基，Transwell 上层小室加入100 μL 细胞，上层小室放入下层下室培养48 h，通过棉签轻轻擦去未发生迁移的细胞，甲醇固定细胞10 min 后，采用结晶紫染色30 min，显微镜下随机选取5 个视野，拍照观察，计算取平均值。

细胞侵袭实验：在不含血清的RPMI1640 培养内按照1∶3 比例稀释Matrigel 基质胶，在Transwell上层小室加入稀释好的100 μL 细胞，其他步骤同上述迁移实验一致。

1.6 蛋白免疫印迹法检测CyclinD1 和MMP-2 蛋白表达

取1.2 各组肺癌细胞A549 采用常规方法提取细胞总蛋白，按照二喹啉甲酸法定量蛋白。冰浴煮沸需要上样的缓冲液，在SDS-PAGE 上样孔内加入40 μg 蛋白样品，转移至PVDF 膜上，室温封闭培养1 h，加入一抗，CyclinD1 抗体、MMP-2 抗体和GAPDH 抗体，4℃过夜培养，加入二抗，室温培养2 h，滴加ECL 显影曝光，分析蛋白条带灰度值，计算CyclinD1 和MMP-2 蛋白。

1.7 双荧光素酶报告实验

取1.2 各组肺癌细胞A549 消化家属，将细胞稀释至1×104个/孔接种至24 孔板中，培养48h。将构建的OIP5-AS1 野生型载体（wt-OIP5-AS1）和突变型（mut-OIP5-AS1）载体与miR-NC 或miR-511-3p 共转染，转染成功后继续培养48 h，采用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性。

1.8 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 进行数据分析；计量资料以（±s）表示，均符合正态分布，两组间比较通过t检验，多组间比较通过单因素方差分析；以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OIP5-AS1 和miR-511-3p 在肺癌细胞中的表达

与正常肺上皮细胞BEAS-2B 相比，肺癌细胞A549、NCI-H23 和NCI-H2170 中OIP5-AS1 表达量均显著增加（P＜0.05），miR-511-3p 表达量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响

与si-NC 组相比，si-OIP5-AS1 组的OIP5-AS1表达、OD 值（48、72 h 时）、迁移、侵袭细胞数目以及CyclinD1、MMP-2 蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表2。

2.3 过表达miR-511-3p 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响

与miR-NC组相比，miR-511-3p组的miR-511-3p表达显著增加（P＜0.05），而OD 值（48 h 和72 h时）、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、CyclinD1 蛋白表达、和MMP-2 蛋白表达均显著降低差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表3。

表2 敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响（±s）Table 2 Effect of knocking down OIP5-AS1 on the proliferation,migration and invasion of lung cancer cell A549（±s）

表2 敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响（±s）Table 2 Effect of knocking down OIP5-AS1 on the proliferation,migration and invasion of lung cancer cell A549（±s）

注：与si-NC 比较，aP＜0.05。

分组si-NC si-OIP5-AS1 t 值P 值OIP5-AS1 2.12±0.25 0.85±0.08a 14.515 0.000 OD（450）48 h 0.71±0.07 0.46±0.05a 8.719 0.000 72 h 0.87±0.07 0.58±0.04a 10.791 0.000迁移细胞数目（个）154.61±16.35 72.42±7.73a 13.634 0.000侵袭细胞数目（个）133.60±12.43 65.65±6.58a 14.494 0.000 CyclinD1 0.98±0.07 0.44±0.05a 18.832 0.000 MMP-2 1.02±0.09 0.51±0.04a 15.535 0.000

表3 过表达miR-511-3p 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响（±s）Table 3 Effect of overexpression of miR-511-3p on the proliferation,migration and invasion of lung cancer cell A549（±s）

表3 过表达miR-511-3p 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响（±s）Table 3 Effect of overexpression of miR-511-3p on the proliferation,migration and invasion of lung cancer cell A549（±s）

注：与miR-NC 比较，aP＜0.05。

分组miR-NC miR-511-3p t 值P 值miR-511-3p 0.48±0.05 1.76±0.17a 21.670 0.000 OD（450）48 h 0.77±0.07 0.52±0.05a 8.719 0.000 72 h 0.92±0.08 0.65±0.06a 8.100 0.000迁移细胞数目（个）141.33±14.82 68.52±5.63a 13.778 0.000侵袭细胞数目（个）136.44±13.16 62.16±5.39a 15.670 0.000 CyclinD1 0.95±0.08 0.49±0.04a 15.429 0.000 MMP-2 0.97±0.08 0.54±0.05a 13.674 0.000

双荧光素酶实验报告结果显示，与miR-NC 组相比，miR-511-3p 组显著降低wt-OIP5-AS1 荧光素酶活性，差异有统计学意义（P＜0.05），对mut-OIP5-AS1 无明显变化，与pcDNA 组相比OIP5-AS1 组的miR-511-3p 表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与si-NC组相比，si-OIP5-AS1组的miR-511-3p表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表4、5。

图3 OIP5-AS1 与miR-511-3p 结合位点Figure 3 OIP5-AS1 and miR-511-3p binding site

表4 双荧光素酶报告实验（±s）Table 4 Double luciferase report experiment（±s）

表4 双荧光素酶报告实验（±s）Table 4 Double luciferase report experiment（±s）

分组miR-NC miR-511-3p t 值P 值wt-OIP5-AS1 0.98±0.07 0.43±0.05 19.181 0.000 mut-OIP5-AS1 0.99±0.08 0.95±0.07 1.129 0.276

表5 OIP5-AS1 调控miR-511-3p 的表达Table 5 OIP5-AS1 regulates the expression of miR-511-3p

2.5 抑制miR-511-3p 部分回复敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响

与si-OIP5-AS1+anti-miR-NC 组相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-511-3p 组的miR-511-3p 表达显著降低（P＜0.05），而OD 值（48、72 h 时）、迁移、侵袭细胞数目、CyclinD1 和MMP-2 蛋白表达均显著增加（P＜0.05）。见图4、和表6。

图4 抑制miR-511-3p 可以部分回复敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的迁移和侵袭的影响Figure 4 Inhibition of miR-511-3p can reverse the effect of knockdown of partial OIP5-AS1 on the migration and invasion of lung cancer cell A549

3 讨论

OIP5-AS1 是在编码OIP5 基因沿着反义方向转录的，最早是在斑马鱼中鉴定出来，在中枢神经系统的早期发育中具有重要作用［7］。OIP5-AS1 在肺腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤和肝母细胞瘤中异常表达，调控肿瘤细胞的增殖和凋亡等机制［8］。Yang 等［9］研究发现，OIP5-AS1 在宫颈癌组织和细胞中表达上调，异常表达与晚期分期、淋巴结转移和总体生存率低显著相关；OIP5-AS1 可以通过miR-143-3p 上调ITGA6 促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭。OIP5-AS1 在肺腺癌组织和细胞中表达上调，OIP5-AS1 通过miR-448 调控肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭［10］。Mei 等［11］研究发现，OIP5-AS1 在非小细胞肺癌表达上调，与肿瘤分期和较差的不良预后有关；抑制OIP5-AS1 抑制非小细胞肺癌细胞的血管形成和侵袭。本研究结果显示，敲低OIP5-AS1的表达可以抑制肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭，说明OIP5-AS1 可以作为肺癌潜在生物标志物。

miRNA 在肺癌细胞异常表达，通过调控细胞的增殖、迁移和侵袭等发挥着作用［12-13］，如miR-124-3p、miR-379-5p 和miR-3655 等［14］。Chi 等［15］研究结果发现，miR-203 在肺癌细胞表达下调，miR-203通过调控RGS17 抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。miR-511-3p 在如乳腺癌中表达下调，LINC02163 通过调节miR-511-3p/HMGA2 轴促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其细胞凋亡［16］，说明miR-511-3p 可以作为肿瘤潜在生物标志物。OIP5-AS1 可以海绵多个下游miRNA参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，本研究结果显示，miR-511-3p 在肺癌细胞中表达下调，过表达miR-511-3p 可以抑制肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭，说明miR-511-3p 可以作为肺癌的生物标志物。进一步实验证明，OIP5-AS1 可以靶向调控miR-511-3p，抑制miR-511-3p 可以部分回复敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响，说明OIP5-AS1 通过调控miR-511-3p 影响A549 细胞的增殖、迁移和侵袭。

表6 抑制miR-511-3p 可以部分回复敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响（±s）Table 6 Inhibition of miR-511-3p can reverse the effect of partial knockdown of OIP5-AS1 on the proliferation，migration and invasion of lung cancer cell A549（±s）

表6 抑制miR-511-3p 可以部分回复敲低OIP5-AS1 对肺癌细胞A549 的增殖、迁移和侵袭的影响（±s）Table 6 Inhibition of miR-511-3p can reverse the effect of partial knockdown of OIP5-AS1 on the proliferation，migration and invasion of lung cancer cell A549（±s）

分组si-OIP5-AS1+anti-miR-NC si-OIP5-AS1+anti-miR-511-3p t 值P 值miR-511-3p 2.33±0.21 1.25±0.12 13.396 0.000 OD(450)48 h 0.43±0.04 0.62±0.06 7.904 0.000 72 h 0.52±0.05 0.76±0.08 7.632 0.000迁移细胞数目（个）75.62±6.96 132.46±12.63 11.825 0.000侵袭细胞数目（个）62.48±7.32 115.93±9.85 13.066 0.000 CyclinD1 0.41±0.04 0.72±0.07 11.535 0.000 MMP-2 0.47±0.05 0.75±0.06 10.755 0.000

综上所述，敲低OIP5-AS1 的表达能够抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与miR-511-3p 有关，旨在为早期肺癌诊断和治疗提供新的作用靶点。