耐碳青霉烯类大肠埃希菌对替加环素异质性耐药的机制

刘宇阳 蓝锴 熊蕊 鲁洋 蔡依玫 向国秀 陈茶 黄彬★

大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）是条件致病菌，常导致免疫低下人群感染［1］。2019年耐碳青霉烯类大肠埃希菌（carbapenem-resistantEscherichia coli，CREC）的全国平均分离率为1.7%，比2018年上升了0.2%。随着多粘菌素耐药基因mcr-1的检出［2］，替加环素（tigecycline，TGC）被认为是治疗CREC 的最后一道防线［3］。不幸的是，已有大量报道显示细菌对TGC 耐药，其主要耐药机制是RND（resistance nodulation division，RND）外排泵系统的上调［4］。研究表明，大肠埃希菌中AcrAB受全局调控因子MarAB 的调控［5］，其外膜通透性受主要膜孔蛋白OmpC、OmpF 和OmpX 的调节［6］。异质性耐药（heteroresistance，HR）意指同一克隆菌株中同时存在对某种抗生素耐药和敏感亚群的现象［7］。HR 的难检出性常导致临床治疗失败和感染复发。目前，耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌对TGC 异质性耐药已有报道［8］，但尚未见CREC-TGC-HR 的报道。本研究对检测异质性耐药的方法进行比较，分析并探讨CREC-TGC-HR的流行情况和耐药机制，为临床治疗和合理应用抗生素提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2017年1月至2019年3月间广州（中山大学附属第一医院17 株、广东省中医院23 株）和宁夏（宁夏医科大学宁夏总医院18 株）两个地区三个中心临床分离的CREC，所有菌株均经Vitek 2 全自动微生物鉴定系统鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，由广东省中医院大学城医院检验科微生物室保存。

1.2 主要仪器与试剂

TGC 粉末购自英国APE-BIO 公司，Mueller-Hinton（M-H）琼脂或M-H 肉汤购自英国Oxoid 公司，Vitek 2 全自动微生物检测系统购自法国生物梅里埃公司，RNA 提取试剂RNAiso Plus、qPCR 试剂盒SYBR Green qPCR Master Mi 和逆转录试剂盒PrimeScript RT 均购自中国大连TaKaRa 公司。ViiA 7 Dx 荧光定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司，GBox 全自动凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司。PCR 引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 改良E-test

参考Andersson 等的方法［7］：将菌液调至2.0 麦氏浊度后，均匀涂布于M-H 平板，贴相应的E-test试纸条，37℃孵育48 h 后观察结果。

1.4 异质性耐药表型初筛

采用菌群谱型分析微量滴定法（microtitration population analysis profiling，MPAP）［9］，配置2-4～24mg/L 共9 个倍比稀释浓度含TGC 的M-H 平板。细菌接种于M-H 肉汤培养基，37℃过夜增菌后，用M-H 肉汤稀释至101～107CFU/mL。取10 μL 菌液滴定于PAP 梯度抗生素平板，每克隆重复两滴，实验重复三次。37℃孵育48 h 后观察细菌生长情况。若最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）与最高不抑菌浓度（the highest noninhibitory concentration，HNIC）的比值大于8，初筛为TGC-HR 阳性。对照菌株为非异质性耐药的大肠埃希菌ATCC 25922 和临床分离的泛耐药大肠埃希菌132A5（本实验室分离的菌株）。

1.5 异质性耐药表型确认

采用菌群谱型分析法（population analysis profiling，PAP）［7］，配置2-4～24mg/L 共9 个倍比稀释浓度含TGC 的M-H 平板。将HR 阳性菌株接种于M-H 肉汤培养基，37℃过夜增菌，梯度稀释后，取20 μL 菌液均匀涂布于PAP 梯度抗生素平板，重复三次。37℃孵育48 h 后菌落计数，并使用Graph-Pad Prism 软件将菌落数量与TGC 浓度作图，若MIC 与HNIC 比值大于8，确认为HR 阳性。对照菌株为非异质性耐药的大肠埃希菌ATCC 25922和临床分离的泛耐药大肠埃希菌132A5（本实验室分离的菌株）。

1.6 基因表达分析

基于PAP 试验，收集CREC-TGC-HR 母菌和异质性耐药亚群各6 株，接种于M-H 肉汤培养基，37℃过夜增菌。用Trizol 法提取菌株的mRNA。参照逆转录试剂盒PrimeScript RT 逆转录出cDNA。参照SYBR Green 试剂盒进行RT-qPCR，并通过相对定量法（2-ΔΔCt）计算各基因相对表达量。qPCR 反应条件：预变性95℃30 s；变性95℃5 s，退火60℃34 s，共40 个循环；熔解曲线95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。所用的PCR 引物序列见表1。

表1 大肠埃希菌RT-qPCR 引物序列［10］Table 1 RT-qPCR primer sequence of E.coli［10］

1.7 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，并进行两独立样本的t检验。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CREC 临床和流行病学特征

本研究共收集到58 株CREC 中最常见的标本类型是痰液20.7%（17/58）和尿液13.4%（11/58），其次是血液11%（9/58）和引流液9.8%（8/58）。科室分布主要是重症监护室（24.4%，20/58）、内科（23.2%，19/58）和外科（18.8%，15/58）。根据Vitek 2 全自动微生物检测系统的药敏检测结果，58 株CREC 中有两株菌对TGC 耐药，后续实验中剔除这两株菌（中山大学附属第一医院和宁夏总医院各1 株）。

2.2 HR 的初筛

对56株TGC敏感菌株进行HR初筛，改良E-test结果显示，14 株CREC-TGC-HR 阳性（25.0%）。MPAP 结果显示，22 株CREC-TGC-HR 阳性（39.3%），其中31.8%（7/22）来自中山大学附属第一医院，22.7%（5/22）来自宁夏总医院，45.5%（10/22）来自广东省中医院。见图1。

图1 CREC-TGC-HR 的MPAP 结果Figure 1 The results of carbapenem-resistanct E.coli CRECHR to tigecycline by microtitration PAP method

2.3 HR 的确认

56 株TGC 敏感的CREC 中，有21 株表现为替加环素异质性耐药（CREC-TGC-HR），检出率为37.5%（21/56）。中山大学附属第一医院、广东省中医院和宁夏总医院CREC-TGC-HR 的检出率分别是43.8%（7/16）、43.5%（10/23）和23.5%（4/17），两两间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。从标本种类分布来看，阳性菌株主要来源于痰液（47.6%，10/21）和尿液（19.0%，4/21）等体液标本。从科室分布来看，阳性菌株主要来源于ICU（38.0%，8/21）、内科（28.6%，6/21）和外科（19.0%，4/21）。见图2。

图2 CREC-TGC-HR 的PAP 结果Figure 2 Population analysis profiles（PAP）of TGC-HR in CREC

2.4 异质性耐药机制

与CREC-TGC-HR 原始菌株相比，CREC-TGCHR 耐药亚群外排泵基因acrA、acrB表达上调1.79倍、5.01 倍；其相关调控基因marA、marB分别表达上调5.38 和2.18 倍；膜孔蛋白基因ompC下调2.35倍，差异均有统计学意义（P＜0.05）。膜孔蛋白基因ompF和ompX的表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 CREC-TGC-HR 原始菌株和耐药亚群各基因mRNA相对表达量（±s）Table 2 Relative mRNA level of gene expression of native populations and HR-subpopulations in CREC-TGC-HR（±s）

表2 CREC-TGC-HR 原始菌株和耐药亚群各基因mRNA相对表达量（±s）Table 2 Relative mRNA level of gene expression of native populations and HR-subpopulations in CREC-TGC-HR（±s）

基因acrA acrB marA marB ompC ompF ompX原始菌株1.094±0.104 0.977±0.103 1.020±0.060 1.283±0.248 1.465±0.421 0.913±0.118 1.175±0.364耐药亚群1.955±0.158 4.860±0.221 5.494±0.313 2.789±0.378 0.617±0.152 0.621±0.203 0.834±0.133 P 值0.001 0.001 0.001 0.004 0.031 0.097 0.202

3 讨论

自1997年首次报道甲氧西林异质性耐药金黄色葡萄球菌［11］以来，已在一些细菌中发现异质性耐药现象，如肺炎克雷伯菌［12］、肺炎链球菌［13］、结核分枝杆菌［14］、鲍曼不动杆菌［15］、铜绿假单胞菌［16-17］和幽门螺杆菌［18］等临床常见致病菌。目前，国内也有少量关于CRE 异质性耐药的报道［19-20］，但其耐药机制不够明确。这些研究大多基于纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B 法）和E-test 法进行HR 初筛。研究发现，K-B 法和E-test 法均存在较高的假阴性率［9］，导致HR 的漏检。本研究结果表明，改良E-test 法与PAP 的阳性检出率相比差异具有统计学意义（P＜0.05），提示E-test 法筛查CREC-HR 存在较高的假阴性率。MPAP 法阳性检与PAP 相比，差异无统计学意义（P＞0.05），提示MPAP 法是目前最接近HR检测金标准PAP 法的检测方法。MPAP 法既比K-B 法和E-test 法有更高的准确度，又比PAP 节约检测成本，操作更简便。但是由于MPAP 采用微量滴定的方法，仍存在一定的假阳性率，仅作为HR 的初筛方法，其实验结果需要用PAP 确认。

有文献报道耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌对TGC的异质性耐药率为20.0%（28/140）［21］，铜绿假单胞菌对头孢吡肟的异质性耐药率为57.3%（110/223）［17］，出现这种差异可能与抗生素种类、细菌种类以及地区差异等因素有关。虽然目前细菌对TGC 的耐药率还处于较低水平，鉴于本研究中发现CREC 对TGC 较高水平的异质性耐药率，应该高度重视关注这个问题。

据报道，大肠埃希菌TGC耐药机制与RND家族AcrAB-TolC 有关，AcrAB 同时受外排泵调节网络中MarAB的调节；marA位点直接或间接增加了micF的表达，导致ompF的表达减少［22］。本研究结果提示RND 外排泵上调与替加环素异质性耐药显著相关。

本研究中大部分CREC 分离自ICU，这部分患者大多数合并多种基础性疾病，且病情复杂，免疫能力相对低下，加上用药情况复杂，更容易感染CREC。大部分CREC 标本来自痰液和尿液，可能与呼吸道和尿道感染有关。但由于本研究存在局限性，CREC 临床标本相对较少，因此，若要进行下一步危险因素分析，仍需扩大样本量。

综上所述，CREC 对TGC 有较高的异质性耐药率。CREC-TGC-HR 与RND 外排泵系统上调有关。采用有效的方法及时检测HR 菌株，有助于临床合理用药，避免HR 菌株发展为耐药菌，可缩短治疗时间和减轻患者负担。