猪场伪狂犬病毒变异与净化

宋国盛，朱利俊，张锦国，郭少春

（1.湖北省武穴市动物卫生监督局，湖北 武穴 435400；2.湖北省武穴市动物疫病预防控制中心，湖北 武穴 435400；3.湖北省武穴市畜牧技术推广站，湖北 武穴 435400；4.湖北省武穴市大金镇畜牧兽医技术服务中心，湖北 武穴 435400)

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的猪繁殖障碍性疫病，可造成新生仔猪发热、腹泻、呕吐及神经症状，死亡率极高[1]。猪伪狂犬病的净化已被列入国家中长期动物疫病防治规划，标记疫苗免疫及鉴别野毒诊断是目前净化该病的主要手段。本试验调查了不同毒株的标记疫苗在不同猪群中的免疫效果、不同猪群的野毒感染情况及净化效果，以期为伪狂犬病的净化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

伪狂犬病毒gB 抗体检测试剂盒（gB-ELISA）、伪狂犬病毒gE 抗体检测试剂盒（gE-ELISA）、伪狂犬病毒PCR 抗原检测试剂盒，武汉科前生物股份有限公司；酶标检测仪，美国BIO-RAP 公司；实时荧光定量PCR 设备，西安天隆科技有限公司；猪伪狂犬病毒弱毒疫苗（变异株）、猪伪狂犬病毒灭活疫苗（变异株），武汉科前生物股份有限公司；猪伪狂犬病毒弱毒（Bartha-K61 株）疫苗、猪伪狂犬病毒灭活（Bartha-K61株）疫苗，某动物保健品有限公司。

1.2 试验设计

对襄大（武穴）农牧有限公司猪场的伪狂犬病毒野毒进行普查，确定是否有变异伪狂犬病毒野毒感染。为选择正确的疫苗种类、免疫时机和免疫剂量，分别进行了下列5个试验。

1.2.1 试验1 对618 头生产母猪、186 头后备母猪进行gE抗体检测和PCR抗原检测，统计检测结果及2种检测方法的符合率。

1.2.2 试验2 对957 头哺乳仔猪进行不同日龄哺乳仔猪的血清学和病原学普查，统计哺乳仔猪不同日龄的野毒带毒情况及2种检测方法的符合率。

1.2.3 试验3 对1 016 头断奶仔猪和育肥猪进行普查，分析变异株野毒感染规律及2 种检测方法的符合率。

1.2.4 试验4 随机抽取100 头生产母猪，分为2组，分别注射国产疫苗和进口疫苗，生产母猪注射时间为产前35、20 d，后备母猪注射时间为配种前35、20 d，分别注射1 头份弱毒疫苗和灭活疫苗；检测疫苗有效抗体的形成时间、达到高峰时间、持续时间、开始衰落时间，对比国产疫苗和进口疫苗免疫后的野毒阳性率。

1.2.5 试验5 根据试验4 分组母猪所产后代自动分组，2 组随机选取478 和479 头哺乳仔猪，分别于42 日龄和65 日龄各注射1 头份伪狂犬基因缺失弱毒苗，检测哺乳仔猪75 日龄的野毒阳性率，进行国产疫苗和进口疫苗的对比试验。

1.2.6 试验6 根据试验5 分组继续检测断奶仔猪不同日龄伪狂犬野毒转阳率，在免疫后150 d 检测育肥猪伪狂犬带毒阳性率以及出栏存活率。

1.3 血清样品的采集与处理

试验1-3 中每头母猪和仔猪无菌采血1 头份，保留有效血清5 mL,检测所有血清中伪狂犬野毒gE抗体和PCR 抗原。试验4每头母猪和仔猪无菌采血1 头份，保留有效血清5 mL,并分别于疫苗注射后15、30、60、90、120、150 d 采血，检测所有血清疫苗gB 抗体和gE 抗体。试验5 每头仔猪无菌采血1 头份，每隔10 d 采血1 次直至75 日龄，每次保留有效血清5 mL。试验6 仔猪和育肥猪每隔10 d 采血1次，直至免疫后150 d，每次保留有效血清5 mL.

1.4 野毒抗体和疫苗抗体滴度检测

按1∶2 的比例稀释待检血清，每1 个样品1 个吸嘴，样品加到酶标孔内之前混合均匀，静置待检。参照伪狂犬病gB和gE抗体试剂盒检测程序进行。

抗体结果判定：①S/N≥0.42 为PRV-gE 抗体阳性。②S/N≤0.38 为阴性。③0.38＜S/N＜0.42 为可疑样品，需要重复试验确定最终结果。

1.5 伪狂犬病毒野毒抗原检测

参照伪狂犬病毒PCR 抗原检测试剂盒操作规程执行。当标本检测Ct值≤35 或有明显指数增长期，判定为阳性；当标本检测Ct值在35～38，应对标本进行重复检测，如重复试验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。当标本检测Ct值＞38 或无Ct值，判定为阴性。

2 结果与分析

2.1 生产母猪、后备母猪PRV gE 抗体和PCR 抗原检测结果

该养殖场一直使用武汉科前生物股份有限公司HB98 伪狂犬基因缺失弱毒疫苗,防控效果较好。试验前期，生产母猪有类似伪狂犬的临床症状，血清学gE 抗体检测结果显示该猪场PRV 感染严重,通过PCR 检测，确认为伪狂犬变异株所引起。从高胎龄生产母猪、青年母猪到后备母猪野毒阳性率呈明显上升趋势，说明野毒是按照后备母猪、青年母猪、高胎龄生产母猪的顺序感染的。由表1可见，4胎以上母猪PRV 抗原与血清学抗体符合率明显降低，说明母猪自身在清除病毒。

表1 生产母猪、后备母猪PRV的gE抗体阳性率与PCR阳性率检测结果

2.2 哺乳仔猪PRV感染gE抗体检测结果

由表2可知，哺乳仔猪gE抗体阳性率较高，PCR抗原阳性率较低，可能与仔猪母源抗体有关；随着仔猪日龄的增长，PCR抗原阳性率上升，这可能与母源抗体不断下降有关。

表2 哺乳仔猪PRV gE抗体阳性率和PCR抗原阳性率检测结果

2.3 断奶仔猪和育肥猪PRV 感染gE 抗体检测结果

由表3可知，仔猪断奶前期，PCR抗原阳性与gE抗体阳性符合率较低，说明存在部分仔猪假阳性的现象，仔猪在90 日龄左右阳性率明显上升，说明疫苗选择和免疫程序还有待改善。

表3 断奶仔猪和育肥猪PRV gE抗体阳性率和PCR抗原阳性率检测结果

2.4 国产疫苗和进口疫苗gB和gE抗体检测结果

2.4.1 国产疫苗和进口疫苗gB 抗体阳性率检测结果 由表4 可知，国产疫苗和进口疫苗的免疫效果均表现良好，免疫后均可产生较高的抗体水平，表明本试验母猪的免疫程序合理。

表4 接种疫苗前后不同时间各组母猪PRV gB抗体阳性率 （单位：%）

2.4.2 国产疫苗和进口疫苗gE 抗体检测结果2 组母猪均为50 头，免疫前阳性母猪均为12 头，gE 抗体阳性率为24.00%；国产变异株疫苗和进口经典株疫苗免疫150 d 分别有3 头、10 头阳性母猪，gE 抗体阳性率分别为6.00%和20.00%。这表明国产变异株疫苗与野毒同源性高，而进口经典株疫苗同源性低，国产变异株疫苗对野毒阻断率要优于进口经典株疫苗。

2.5 哺乳仔猪国产疫苗和进口疫苗野毒抗体检测结果

国产变异株疫苗共免疫哺乳仔猪478 头，免疫前阳性仔猪为94 头，gE 抗体阳性率为19.67%；免疫后75日龄阳性仔猪为5头，gE抗体阳性率为1.05%。进口经典株疫苗共免疫哺乳仔猪479 头，免疫前阳性仔猪为94 头，gE 抗体阳性率为19.62%；免疫后75日龄阳性仔猪为14 头，gE 抗体阳性率为2.92%。哺乳仔猪注射疫苗前后，国产变异株疫苗组和进口经典株疫苗组伪狂犬野毒阳性率没有明显差异。

2.6 断奶仔猪和育肥猪国产疫苗和进口疫苗gE抗体检测结果

国产变异株疫苗共免疫断奶仔猪和育肥猪478头，免疫前阳性数为144 头，gE 抗体阳性率为30.13%；免疫后150 d 阳性数为39 头，gE 抗体阳性率为8.16%；出栏472 头，出栏率为98.74%；进口经典株疫苗共免疫479 头，免疫前阳性数为143 头，gE抗体阳性率为29.85%；免疫后150 d阳性数为138头，gE 抗体阳性率为28.81%；出栏443 头，出栏率为92.48%。这表明，国产变异株疫苗组和进口经典株疫苗组对断奶仔猪和育肥猪的野毒感染阻断率差异明显，国产变异株疫苗对野毒有良好的阻断效果。此外，国产变异株疫苗组的出栏数和出栏率也明显更高。

3 小结与讨论

国产变异株疫苗和进口经典株疫苗都为我国规模化猪场猪伪狂犬病防控做出了重要贡献[2]，均具有抗体上升速度快、抗体滴度高、稳定、保持时间长等优点。但从试验结果可知国产变异株疫苗相较于进口经典株疫苗对变异毒株的阻断能力明显更强。

免疫之前，该猪场母猪出现产死胎、弱仔、流产等症状，是病毒急性感染胎盘的临床表现。但母猪自身抗病毒的能力较强，病毒感染表现为隐性，母猪gE 抗体阳性率呈逐步下降的趋势。病毒一旦感染母猪，会终身在其神经系统潜伏。从试验4 结果可知，感染过病毒的母猪经过疫苗强化免疫，虽然能清除血液中的病毒，但不能清除神经系统中病毒。哺乳仔猪出生表现出神经症状、腹泻症状，出现高死亡率，这与野毒的毒力有关，如果阻断病毒通过血液向胎盘传播，这些临床症状都可以减轻甚至消除。

从断奶仔猪的检测结果可知，90 日龄时仔猪抗体水平最低，此时是变异株伪狂犬野毒感染断奶仔猪的重要时期，随后育肥猪群病毒载量会不断增加，育肥猪群会出现严重咳嗽、喘气等临床症状，紧急接种伪狂犬弱毒疫苗可以明显改善临床症状。因此，在哺乳仔猪65 日龄第2 次接种伪狂犬灭活苗或在90 日龄再接种1 次伪狂犬灭活苗，可以保持育肥猪高抗体水平，从而减少育肥猪感染野毒。控制猪场伪狂犬病的关键是要控制育肥猪群病毒载量，90 日龄猪群是野毒感染最开始的阶段，育肥猪又是猪场最大的饲养群体，因此猪场要着重解决好育肥猪的问题。

自2011 年开始报道猪伪狂犬变异毒株以来[3]，该病已在世界范围内流行。襄大（武穴）农牧有限公司养殖场也感染了变异株伪狂犬病毒，试验开始前，该猪场伪狂犬病毒不稳定，表明国内外生产的基因缺失弱毒疫苗已出现免疫失效，建议使用国产变异株弱毒疫苗并配合使用变异株灭活疫苗，以加强猪群对PRV的免疫。

国产猪伪狂犬变异株疫苗可以明显降低母猪和育肥猪野毒gE 抗体阳性率，其对变异株野毒的阻断能力明显高于进口经典株疫苗。应加强对猪伪狂犬变异株疫苗的研制及免疫程序的研究，以实现变异株猪伪狂犬病可防可控，规模化猪场可以通过消毒、免疫、隔离、捕杀、补充阴性猪群等生物安全措施进行净化。