猪源肠外致病性大肠杆菌致脑膜炎机制的研究进展

杨晓培，倪杨帆，赵 静，万 云，黎 巧，肖 冉，岳 龙，黄 微，袁晓丹，杨 洋，谢文浩，阮 征

（1.武汉市动物疫病预防控制中心，武汉 430070；2.武汉农业检测中心，武汉 430014）

细菌性脑膜炎是一种严重危及生命的疾病，它是由于细菌感染导致的中枢神经系统疾病，其发病率和死亡率较高。随着现代医学不断进步，诊断技术和针对性的抗生素治疗手段不断完善，细菌性脑膜炎的诊疗情况有所进展，但由于其难以确诊、病程发展迅速、缺少有效的疫苗预防等特点，仍严重威胁着人类的生产和生活。在我国，肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）作为一种人畜共患病细菌，菌群耐药情况复杂，大多数细菌性脑膜炎病例由血源性扩散引起，当循环的细菌穿透血脑屏障（BBB）时，将破坏脑实质并最终引起中枢神经系统疾病，近一半的幸存者患有不同程度的神经系统疾病（如智力迟钝、听力障碍和失明）。数据显示，在不同地域和不同年龄段，ExPEC 导致的细菌性脑膜炎病例占全部病例的50%；在3 岁以下的儿童群体中，该病的死亡率达21%，10%～20%的幸存患者会出现认知障碍、双侧听力丧失、运动障碍、癫痫、视力受损和脑积水等神经系统后遗症［1，2］。

1 猪源肠外致病性大肠杆菌的研究

目前，大肠杆菌致脑膜炎主要以K1荚膜菌株为研究对象［3］。研究发现，感染PCN033 菌株的小鼠脑组织的病理切片显示出明显的脑膜炎病变［4］。PCN033菌株属于临床分离的猪源ExPEC，是1种K2荚膜菌株，现对其在细菌性脑膜炎机制的研究进展进行探讨。

ExPEC 与毒力相关的因子包括脂多糖（LPS）、荚膜、菌毛、鞭毛、生物被膜、分泌系统、铁离子摄取与转运系统等，这些毒力因子在引起细菌性脑膜炎的过程中起到重要作用。LPS 作为革兰氏阴性菌细胞膜的主要成分，可在宿主体内诱发强烈的免疫反应。Bao 等［5］发现，在引起脑膜炎的过程中，LPS 能够结合机体产生的溶菌酶，降低溶菌酶活性，从而减弱溶菌酶对细菌的杀伤作用。荚膜是细菌的表面抗原，耐干燥、促进细菌与细胞表面、细菌之间的黏附、抵抗宿主免疫系统。Kim［3］发现，细菌表面K1 荚膜能够抑制溶菌酶与内吞小泡结合，有利于细菌存活、繁殖，最终跨越BBB 进入中枢神经系统。菌毛、鞭毛菌有黏附细胞的功能，且鞭毛与生物被膜的形成有关。Liu 等［6］在研究鞭毛系统对hBMEC粘附作用时发现，Flag-1 系统在鞭毛结构的合成和成熟中起到重要作用，编码鞭毛钩支架蛋白的flgD基因是介导细菌游动和群集的重要蛋白，flgD缺失可减弱ExPEC菌株在体内的侵袭和定殖。

2 猪源肠外致病性大肠杆菌感染hBMECs组学研究

BBB 主体结构由单层hBMECs 有秩序的排列形成致密层，这种致密的结构可以将脑和血管内的空间隔离开来，同时细胞顶部和细胞基底外侧的表面蛋白发生极化。Liu 等［7］、Yang 等［8］通过将PCN033与hBMECs 互作后收集细胞，分别提取hBMECs 蛋白和RNA，比较感染前后hBMECs 蛋白和RNA 的变化，寻找猪肠外致病性大肠杆菌致人脑膜炎关键分子。

2.1 蛋白组学研究

Liu等［7］通过比较感染前后蛋白组学发现，主要有2 大类蛋白的表达发生了改变，他们分别参与了PCN033 诱导的紧密连接损坏和神经炎症反应。巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）促进了脑膜炎大肠杆菌诱导细胞因子和趋化因子的产生，并通过降低ZO-1、occludin 等紧密连接蛋白，有助于破坏血脑屏障；同时发现NF-κB 和MAPK 信号通路在hBMECs对脑膜炎大肠杆菌的响应中起主导作用，主要包括IL-6、IL-8、TNF-α 和IL-1β 在内的促炎细胞因子的产生。

2.2 转录组学研究

近年来，长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（CircRNA）的研究主要集中在肿瘤方面，他们在细菌性脑膜炎中的调节作用还尚不明确。通过RNA测序，Yang 等［8］发现PCN033 感染hBMECs 中有25 257 个lncRNA 发 生改 变，包括24 645 个 已注 释和612 个新发现的；共有895 个lncRNA 表现出显著差异，其中有382个上调，513个下调，通过生物信息学分析，预测了lncRNA 的特征以及lncRNA 与mRNA之间潜在的调控关系。Yang 等［9］通过组学数据分析发现细菌性脑膜炎相关RNA，进一步验证发现了hsa-miR-93-5p 与血管内皮生长因子A（VEGFA）之间的负调控关系，hsa_circ_2858 可以竞争结合hsamiR-93-5p；hsa_circ_2858 过表达之后，VEGFA 表达显著上调，但同时对hsa-miR-93-5p 进行过表达后，hsa_circ_2858对于VEGFA 的上调作用受到了完全的抑制［9］。

Yang 等［10］在PCN033 感染星形胶质细胞的转录组学分析中发现，有2 045 个mRNA、74 个lncRNA、27 个miRNA 和418 个circRNA 被差异表达。星形胶质细胞中mRNA 显著上调主要与TNF、HIF-1、NF-κB、MAPK 等炎症信号通路及凋亡有关；mRNA 靶向上调的lncRNA 主要富集于ErbB 和mTOR 信号通路，下调的lncRNA 靶点与运输和代谢途径相关，包括囊泡运输中的SNARE 相互作用、唾液分泌、组氨酸代谢及β-丙氨酸代谢。

3 BBB模型的构建及研究

BBB 是细菌感染脑膜炎前的最后一道屏障，它主要由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周皮细胞构成。hBMECs 通过表面的紧密连接蛋白组成了BBB 的主体结构。小胶质细胞在外与周皮细胞、星形胶质细胞共同构成BBB的免疫细胞群。

3.1 紧密连接蛋白

通过对PCN033 感染小鼠和hBMECs 的体内体外研究发现，ExPEC 感染锌指转录抑制因子（Snail-1）缺失的hBMECs，细胞表面紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5、β-catenin 均发生显著下调，表明Snail-1调控了上述蛋白的表达［11］。

3.2 细胞骨架蛋白

肌动蛋白丝是由双链蛋白集合而成的高度组织化的结构单元，包括肌动蛋白束、肌动蛋白网状物、皮质肌动蛋白微丝和膜表面的细胞骨架蛋白，这些结构通过微管、微丝和中间丝纤维结合形成细胞骨架。研究发现hBMECs感染PCN033后，激活了表皮生长因子受体（EGFR），其相关配体HB-EGF被激活，活化的EGFR 与ErbB3 形成二聚体，竞争性地从细胞内的F -actin 招募和分解ACTN4，导致宿主细胞肌动蛋白细胞骨架重排，最终促使细菌入侵［12］。

3.3 通透性

目前检测细菌突破BBB 的方法主要包括细胞体外共培养模型［13］、脑部载菌量检测［11］和染料渗透性检测［11］3 种方法，通过相互验证判断细菌感染是否突破BBB。

4 PCN033致细菌性脑膜炎免疫机制研究

PCN033 成功穿透BBB 在体内形成菌血症，完成对hBMECs的侵袭，在此过程中PCN033通过细胞穿透血屏障而不改变hBMECs 单层的完整性，通过特定的宿主细胞因子和细胞信号转导途径介导脑膜炎的发生，其潜在机制仍不明晰［14］。

研究发现，PCN033 感染hBMECs 后，hBMECs 表面多个重要蛋白、lncRNA 的表达发生了改变，细胞内信号通路被激活，从而介导神经炎症的发生。PCN033 感染hBMECs 后，诱导脑微血管内皮血管生成素样4（ANGPTL4）高表达，通过激活ARHGAP5/RhoA/MYL5信号通路，增加MYL5的表达，破坏BBB功能［13］；Yang 等［11］发现，PCN033 感染诱导VEGFA和Snail-1 的上调，并由此激活TLR2-MAPK-ERK1/2 信号通路，感染反应中促炎细胞因子和趋化因子的产生也促进了VEGFA 和Snail-1 的上调，从而进一步介导了BBB 的破坏；Yang 等［15］发现ICAM-1 的上调有助于中性粒细胞或单核细胞募集，以及脑膜炎大肠杆菌感染后的神经炎症破坏；Amjad 等［16］发现，PCN033 感 染hBMECs 后，miR-19b-3p 显著下调，从而通过增加NF-κB 信号的负调控因子TNFAIP3 的表达来降低促炎细胞因子和趋化因子的产生。

5 小结

目前，PCN033 的致病机制在研究中不断被发掘，研究主要集中在细菌的毒力因子的作用和相互作用的细胞表面蛋白和重要转录因子。近年来，关于ncRNAs 的功能报道也逐渐增多，其在病原菌致病的各个环节发挥着直接或者间接的调控作用；进一步探究ExPEC 感染过程中circRNAs 的调控机制，也有助于加深对CNS 感染性疾病的理解。了解Ex-PEC 与宿主相互作用机制，也有助于预防和治疗由ExPEC导致的脑膜炎。