不同产地红花指纹图谱建立及其抗氧化活性研究

吴孟霏，李春玲，任 河，孙玉琦

（锦州医科大学 药学院，辽宁 锦州121001）

红花为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L．）的干燥花，是传统的活血化瘀中药，具有活血通经，散瘀止痛之功效[1]。 已有研究证明，羟基红花黄色素A(SY)是红花的有效成分，具有抗氧化，抑制血小板聚集，改善心肌供血，抑制血栓形成等功效[2]。 近年来我国许多地方大面积种植红花，其中新疆因其独特的环境成为红花主要产地。由于产地和其他因素的不同，使得不同产地红花的质量存在差异。目前《中国药典》（2020 版）规定以红花中SY 含量来作为评价红花药材质量的标准[3]。中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，它将能较为全面地反映中药中所含化学成分的种类与数量，同SY 的含量测定相结合，能更好的对中药质量进行整体描述和评价。 目前，从红花中分离出200多种化合物，包括多炔类、黄酮、甾体类、醌式查尔酮苷类、倍半萜类，其中很多的黄酮类和醌式查尔酮苷类成分已报道具有抗氧化和清除自由基的活性[4]。DPPH 法测定红花药材清除自由基、抗氧化的基理是二苯基苦味肼基自由基[DPPH·]是一种稳定的以氮原子为中心的自由基，最大吸收在515 nm 波长[5]。 [DPPH·]乙醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。 在[DPPH·]乙醇溶液中加入红花抗氧化提取物后，红花抗氧化提取物可以与[DPPH·]自由基结合或发生替代，使[DPPH·]自由基数量减少，溶液颜色变浅，表现为：其在515 nm 波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。 因此，可以通过在515 nm 波长处检测红花抗氧化提取物对[DPPH·]自由基的清除效果，考察其抗氧化活性。

本研究通过高效液相色谱法（HPLC)，对新疆塔城、新疆伊犁、新疆乌鲁木齐、新疆吉木萨尔、新疆哈密、新疆伊宁、新疆昌吉、新疆阿克苏、四川简阳市、云南大理、河南省开封市、陕西宝鸡、内蒙古包头、浙江东阳、甘肃兰州15 个不同产地红花药材中SY 含量进行测定，进行指纹图谱研究及红花抗氧化活性差异的考察。

1 材料与方法

1.1 材料

供试15 个产地红花分别来自新疆塔城、伊犁、乌鲁木齐、吉木萨尔、哈密、伊宁、昌吉、阿克苏，四川简阳市，云南大理，河南开封，陕西宝鸡，内蒙古包头，浙江东阳和甘肃兰州。 供试羟基红花黄色素A 对照品为中国食品药品检定研究院提供，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼和维生素C 购自美国Sigma 公司。 甲醇、乙醇、乙腈、磷酸均为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为超纯水。

试验采用的仪器有：超声波清洗机（东莞康士洁超声波科技有限公司）、Agilent1100 高效液相色谱仪（日立公司）、UV-2550 型UV-Vis 分光光度计(日本岛津公司)、RE-52A 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、AL-204型电子天平(上海仪器厂）和中药粉碎机（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 羟基红花黄色素A 的含量测定 羟基红花黄色素A 对照品溶液配制： 称取羟基红花黄色素A 对照品6．5mg，溶解在25%甲醇溶液中，使其浓度为0．13mg·mL-1，即得SY 对照品溶液[6]。 供试样品羟基红花黄色素A溶液的提取：称取供试15 个不同产地红花药材粉末各0．40g，加入50%乙醇10mL，密闭环境保存24h 后，50℃超声提取30min，滤过，提取液过0．45μm 微孔滤膜滤备用。

色谱条件：Alltech Alltima-C18 色谱柱(4．6mm×250mm，5μm)； 流动相为甲醇-乙腈-0．7%磷酸溶液 （26∶2∶72），检测波长403nm；流速为1mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为10μL。

将供试品溶液和对照品溶液按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，根据式（1）计算15 个不同产地红花羟基红花黄色素A 含量。

式中：Cx为供试品浓度；CR为对照品浓度；Ax为供试品峰面积；AR为对照品峰面积。

1.2.2 指纹图谱的建立 色谱条件:Alltech Alltima-C18色谱柱(4．6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈(A)-0．5%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱程序见表1，运行时间60min，流速为1mL·min-1， 检测波长为265nm；柱温为30℃；进样量10μL[7]。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.3 指纹图谱的建立方法及相似度评价 将所得HPLC 图谱依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版”软件，对其峰数、峰面积和保留时间等相关参数进行分析。通过软件中的“相似度计算”功能进行供试品色谱图谱与对照图谱的相似度评价[8]。

1.2.4 红花的抗氧化性

1.2.4.1 提取溶剂的筛选 称取新疆塔城红花药材粉末3 份，各2g，分别以50%甲醇，50%乙醇和50%丙酮超声振荡提取20min，减压浓缩至干，用无水乙醇溶解，定容于5mL 棕色瓶中，4℃保存，备用。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除能力标准曲线的绘制 称取2．5mg[DPPH·]加无水乙醇定容至100mL 容量瓶中，摇匀，备用。 将适量VC 溶解于无水乙醇中，配制成0．1，0．2，0．3，0．4，0．5mmoL·L-1VC 乙醇溶液。 将3．9mL[DPPH·]反应液和0．1mL 的一系列VC 乙醇溶液混合，37℃下保存10min，采用紫外可见分光光度法于515nm 处测定吸光度，根据式（2）计算清除率K[9-10]。 以VC 的浓度为横坐标(X)，清除率为纵坐标(Y)进行线性回归，得标准曲线：Y=0．601X+0．0411，R2=0．9975，在0．1～0．5mmoL·L-1范围内线性关系良好。

1.2.4.3 提取溶剂的确定 取[DPPH·]反应液3．9mL，分别与3 种不同溶剂的新疆塔城红花药材提取物的不同体积（10～70μL)的供试品混合，无水乙醇补足至4mL 到EP 管中，37 ℃下保温10min，采用紫外可见分光光度法于515 nm 波长处测定吸光度，按式（2）计算清除率，测定VC 含量。 根据加入样品体积V（μL）与清除率K（%）的关系，以加入供试品的体积（10，20，30，40，50，60，70，80μL）为横坐标，清除率K（%）为纵坐标绘制曲线。

1.2.4.4 抗氧化活性测定 取各产地红花抗氧化成分提取物0．1mL 至EP 管中，加入[DPPH·]反应液3．9mL，37℃下保存10min，采用紫外可见分光光度法于515nm 波长处测定吸光度，按式（2）计算清除率，测定维生素C含量（VCEAC)。

2 结果与分析

表2 不同产地红花的含量Table 2 Content of safflower from different origins

2.1 不同产地红花羟基红花黄色素A 的含量

不同产地红花药材SY 的含量见表2， 甘肃兰州和陕西宝鸡红花药材不符合2020 版中国药典规定。 四川简阳和云南大理产的红花SY 含量最高，超过3%。

2.2 指纹图谱的建立及相似度评价

15 个不同产地红花指纹图谱见图1；15 个不同产地红花之间相似度见表3。 经相似度软件分析，15 个产地红花药材除新疆塔城，甘肃兰州，陕西宝鸡相似度较低外，其他产地红花药材相似度在0．9～1．0 之间，说明与标准红花药材存在差异。

2.3 不同产地红花药材指纹图谱的聚类分析

由图2 可知，15 个不同产地红花药材最终可聚成2大类，其中甘肃兰州红花药材和陕西宝鸡红花药材为一类，从含量测定结果看甘肃兰州和陕西宝鸡红花药材羟基红花黄色素A 不符合药典标准。 其他产地红花药材聚为一类，从含量测定结果看其他产地红花药材羟基红花黄色素A 符合药典标准。 药典方法鉴定结果同聚类分析鉴定结果相同。15 个不同产地红花药材可被分为2类，说明产地对红花质量的综合评价影响不大，提示红花的质量除了与其产地有关外，还与红花生长的环境、种植的时间、放置的温度等因素有关[11-12]。

2.4 红花的抗氧化性

2.4.1 提取溶剂的确定 由图3 可知，在一定的浓度范围内，红花提取物的清除率均随着提取物浓度的增加，呈现一定的正比例关系。红花提取物、维生素C 对DPPH 自由基均有一定程度的抑制作用。用50%乙醇提取的新疆塔城红花药材的抗氧化能力相比于用50%甲醇和50%丙酮要高，所以采用50%乙醇进行红花药材抗氧化成分的提取。

图1 不同产地红花的指纹图谱Figure 1 Fingerprint of safflower from different origins

表3 不同产地红花相似度Table 3 Similarities of safflower from different origins

2.4.2 抗氧化活性测定 由表4 可知，不同产地红花抗氧化能力依次为新疆塔城红花＞新疆伊宁红花＞新疆吉木萨尔红花＞新疆阿克苏红花＞新疆乌鲁木齐红花＞新疆伊犁红花＞新疆哈密红花＞浙江东阳红花＞新疆昌吉红花＞内蒙古包头红花＞云南大理红花＞四川简阳红花＞河南开封红花＞陕西宝鸡红花。

图2 不同产地红花聚类结果树状图Figure 2 Clustering results of safflower from different origins

图3 不同浓度供试品提取物DPPH 清除能力Figure 3 Clearance capacity DPPH different concentrations of sample extracts

表4 不同产地红花清除率Table 4 Removal rate of safflower from different origin

3 讨论与结论

随着社会的发展、人们生活水平的提高、自然环境的变化，心脑血管疾病发病率呈逐年递增趋势，这时仅通过西药来治疗疾病有一定的局限性，这也使得人们更加关注中医药的治疗作用，而中草药凭借药效稳定、安全性高等优点赢得中外学者的瞩目[13-15]。 对于SY 的含量测定和指纹图谱的建立，分别采用不同浓度甲醇、乙醇进行超声提取。结果表明：乙醇提取出的产物相比甲醇提取出的含量相差不大，但乙醇提取的产物相对应的指纹图谱的色谱峰更加清晰，不杂乱；对于乙醇浓度的选择过高或过低均对SY 的含量产生影响，且与后续抗氧化实验的提取溶剂相同，更好的对不同产地红花的质量进行监控，故采用50%乙醇超声提取。 本实验选择指纹图谱中峰面积最大的有效成分SY 进行含量测定，研究结果表明不同来源的红花药材SY 的含量在0．48～32．5mg·g-1，具有较大波动，表明不同产地的红花药材质量存在较大的差异，对于不同产地红花药材的选用还需进一步认真考察[16]。 本研究建立了SY 指纹图谱结合有效成分含量测定的质量评价方法，从有效成分含量的角度上更全面、准确、有效的控制红花的质量，保证其药效，将为进一步体外抗氧化性，体内药动学、早期安全性评价等成药效物质基础研究提供实验依据[17]。

本研究考察了不同产地红花药材的抗氧化性， 通过采用50%甲醇，50%乙醇，50%丙酮对新疆塔城红花药材进行提取，发现50%乙醇提取的红花抗氧化能力较好。 红花药材的抗氧化性的能力与SY 的含量大小有关，据报道，红花中的黄酮类成分SY 和红花黄色素B 均有抗氧化活性[18-19]。 云南红花药材SY 的含量高于新疆塔城红花药材，但其抗氧化活性不如新疆塔城红花药材，可能由于其中其他抗氧化成分高于新疆塔城红花药材，如黄酮类成分红花黄色素B[20]。