DCTPP1基因在乳腺癌中的表达及其生物信息学分析*

贾春丽,路鹏霏,邱 萍,杨 颖,吴 戈,张瑞丽,毛 睿,张 华

(新疆医科大学第一附属医院肿瘤中心，乌鲁木齐 830000)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，全球女性中每年新发乳腺癌患者约有200万，乳腺癌的发病率在逐年增长[1]，严重威胁女性健康。而在我国，每年有上万例女性死于乳腺癌[2]。核苷三磷酸焦磷酸水解酶(NTP-PPase)可以水解核苷三磷酸(d)NTP的磷酸二酯键形成核苷单磷酸(d)NMP，释放焦磷酸。NTP-PPase水解异常核苷酸明显减少了细胞核苷酸池中的异常核苷酸，避免了DNA合成过程异常核苷酸的掺入，提高了DNA复制的准确性[3]。DCTPP1基因是NTP-PPase家族中的成员，具有NTP-PPase活性，有研究报道其为抗肿瘤药物研发的潜在靶点[4-5]，在DNA复制过程中发挥了重要作用[6]。然而，目前对DCTPPl在临床乳腺癌组织中的表达及功能等相关研究报道较少。本研究旨在利用肿瘤相关数据库，明确DCTPPl在乳腺癌中的表达、分布状态及与乳腺癌患者预后的关系，探讨DCTPP1在乳腺癌发生发展中所发挥的功能，为DCTPP1基因在乳腺癌中的研究奠定基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

TCGA(The Cancer Genome，Atlas http://cancergenome.nih.gov/)数据库包括了肿瘤病例临床基本信息，如基本资料，治疗进程，临床分期，肿瘤病理及生存状况，包括mRNA、microRNA、Copy Number、Mutation、Protein、Methylation信息等。利用ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/)对TCGA数据库中包括乳腺癌组织和及正常组织中的多种肿瘤组织及正常组织中DCTPP1基因mRNA的表达水平进行分析。Human Protein Reference Database是一个专门存储人类蛋白质相互作用信息的数据库，在该网站查询DCTPP1基因在乳腺癌组织及正常组织中蛋白的表达状况。

1.2 方法

1.2.1生存分析

利用基因表达谱数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库加载了TCGA数据库中的相关数据，利用其中乳腺癌患者DCTPP1基因mRNA的表达数据分析DCTPP1基因表达水平与乳腺癌患者预后的关联。

1.2.2病理亚型及年龄状况

采用ualcan数据库中存储的TCGA 数据分析DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亚型的表达状况。

1.2.3蛋白相互作用网络

genemania数据库可提供蛋白-蛋白，蛋白-DNA 和遗传相互作用、通路、生理生化反应等信息，利用该数据库DCTPP1蛋白参与的蛋白-蛋白，遗传相互作用和通路、蛋白共表达网络。

1.2.4基因功能

WebGestalt是一个基因功能富集分析的在线网站，将与DCTPP1基因相互作用的关键基因利用WebGestalt进行GO分析，了解其参与的细胞组分、生物过程、生物功能。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0软件进行数据分析，采用Kaplan-Meier生存分析计算生存率，采用logrank检验估计生存率的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌组织及正常组织中DCTPP1基因的差异性表达结果

通过ualcan网站在线分析TCGA乳腺癌患者数据库中乳腺癌基因表达的相关信息，对比1 097例乳腺癌组织与114例正常乳腺组织中DCTPP1基因mRNA的表达水平发现，乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常乳腺组织(P<0.01)，见图1。

图1 基于TCGA数据库分析乳腺癌组织及正常乳腺组织DCTPP1基因mRNA的表达水平

2.2 DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亚型的表达水平

基于ualcan数据库进行分析，结果显示，TNM临床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者癌组织中DCTPP1基因表达水平显著高于正常乳腺组织(P<0.01)，Ⅲ期乳腺癌患者癌组织中DCTPP1基因表达水平与Ⅰ期乳腺癌组织中该基因的表达相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Luminal型乳腺癌患者癌组织中DCTPP1基因表达水平显著高于正常乳腺组织(P<0.05)，HER-2过表达型、三阴型乳腺癌患者癌组织中DCTPP1基因表达水平明显高于正常乳腺组织(P<0.05)，见图2。各病理亚型乳腺癌组织中DCTPP1基因表达均高于正常乳腺组织(P<0.01),其中Lumnial型乳腺癌该基因的表达明显高于三阴型乳腺癌(P<0.01)，见图3。

图2 正常乳腺组织与不同分期乳腺癌组织中DCTPP1基因mRNA表达水平比较

图3 正常乳腺组织与不同病理分型乳腺癌组织中DCTPP1基因mRNA表达水平比较

2.3 DCTPP1蛋白乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达

免疫组织化学检测结果显示，乳腺小叶癌组织中和乳腺导管癌组织中DCTPP1基因的表达呈现强阳性。进一步观察乳腺癌组织中DCTPPl蛋白阳性的细胞分布格局，发现肿瘤细胞的细胞膜、细胞质及细胞核均有DCTPPl蛋白的表达，其中细胞质浅棕黄色，细胞核及细胞膜呈棕褐色。在正常乳腺组织中，DCTPPl在部分腺体细胞表达，主要位于细胞核与细胞膜，在脂肪组织中不表达，见图4。

A、B：浸润性癌；C、D：导管癌；E、F：正常乳腺组织。

2.4 DCTPP1基因表达水平与乳腺癌患者预后的关系

利用TCGA数据库分析DCTPP1基因不同表达水平与乳腺癌患者预后的关联，分析1 070例乳腺癌患者的总体生存时间，以DCTPP1基因表达的中位数为标准将患者分为DCTPP1基因高表达组(n=535)与DCTPP1基因低表达组(n=535)，分析结果表明，相对于低表达的患者，DCTPP1基因高表达降低了乳腺癌患者总体生存时间(HR=1.9,P<0.01)，见图5。

图5 基于TCGA数据库中DCTPP1基因不同表达水平乳腺癌患者总体生存率分析

2.5 DCTPP1蛋白相互作用网络预测及功能分析

genemania分析共筛选出20个DCTPP1基因相互作用蛋白质：BAP1、CAPZB、CIAPIN1、CTPS1、HERC4、LGI1、LGI2、LGI3、LGI4、MRPL21、NUBP1、PCNA、PDE12、PLK1、POLR3K、RAD23A、TSPEAR、UBQLN1、WDR74、XPNPEP1，相互作用关系包括物理相互作用、共表达、共享蛋白质结构域、共定位，见图6。

图6 DCTPP1基因相互作用蛋白分析

2.6 GO分析

对上述基因参与的生物学过程、细胞组分、分子功能进行分析发现，这些蛋白主要参与了代谢过程、生物调控、应激反应、细胞通信等过程。DCTPP1基因相关基因位于多种细胞成分中，包括细胞质、细胞核、囊泡、线粒体、被膜等。分子功能包括结合蛋白质、结合离子、水解酶活性、转移酶活性、结合核苷酸、结合核酸等，见图7。

A：生物学过程；B：细胞组分；C：分子功能。

3 讨 论

世界范围内，美国和北欧是乳腺癌高发，而亚洲地区发病率最低[7]，中国不是乳腺癌的高发国家，但由于人口基数庞大，每年女性乳腺癌新发病例的绝对数很多，位居世界第2位；每年因乳腺癌死亡的人数位列中国女性因肿瘤死亡人数的第6位[8-9]。近年来血管内皮生长因子、人表皮生长因子受体、细胞周期检查点调节剂等靶向药物在乳腺癌中的应用逐渐增多，然而这些靶点仅存在于部分乳腺癌患者，因此寻找乳腺癌发生发展的关键分子或靶点，对开发新的治疗乳腺癌的靶向药物具有重要意义。

人体内的正常细胞在不断进行自我更新，其中极为关键步骤是DNA复制，而该过程是细胞中是一个非常准确的过程，每代每个基因产生10-7个错误[10]，该过程出现差错会导致基因发生突变，发生突变细胞中的一部分细胞就会变成前癌细胞。在人体内肿瘤微环境的作用下前癌细胞转化为癌细胞。肿瘤细胞内异常核苷酸代谢对于肿瘤微环境的形成和维持、肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移等有着非常重要的作用[11]。

NTP-PPase家族在低等的原核生物和高等真核生物中都存在，该酶水解底物包括核苷三磷酸和异常核苷三磷酸[3]。NTP-PPase若缺失会导致DNA突变的增加，并影响细胞分裂。如大肠杆菌的MutT酶可以选择性清除核苷酸池中的氧化核苷酸8-oxo-dGTP和2-OH-dATP，这一过程阻止了氧化应激导致的异常核苷酸掺入到DNA中造成的DNA损伤。在大肠杆菌中MutT的缺失导致大肠杆菌的AT-CG突变率大大增加[12]。在结核分枝杆菌中的MazG水解dUTP、2-hydroxy-dATP和8-oxo-dGTP等，该酶缺失可以造成编码利福平抗性基因的突变明显增多，从而影响结核分枝杆菌的正常生长[13]。因此，NTP-PPase在生物过程中不断分解细胞代谢过程中的异常核苷酸，保证了DNA复制的准确性及生物体基因组的稳定性。而作为被在人类细胞中发现的具有典型MazG结构域的NTP-PPase，DCTPP1基因是众多已发现的NTP-PPase中研究报道较少的活性蛋白分子，对其酶学特性及功能研究结果提示该分子可以特异性水解dCTP和结构类似物如5-甲基-dCTP和5-卤-DCTP[14]。

ZHANG等[4]研究多种肿瘤中DCTPP1基因的表达模式及与对应的癌旁组织之间的表达差异，与癌旁组织中的表达进行对比发现，在肺癌组织中DCTPP1基因显著高表达，而DCTPP1基因在胃癌及结直肠癌中的表达并没有显著差异，同时在不同组织学亚型的肿瘤中表达状况也不同。本研究结果显示，DCTPP1基因在乳腺癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织。这与上述肿瘤中DCTPP1基因的表达模式相同。DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、不同分子病理分型(Lumnial型、HER-2阳性过表达型、三阴型)的表达均较正常组织高，且以Lumnial型、三阴型明显。在Human Protein Reference Database数据库中对乳腺癌组织及正常乳腺组织采用免疫组织化学法检测DCTPP1蛋白的表达发现，DCTPP1蛋白在乳腺导管癌及小叶癌中的表达均高于正常乳腺组织，SONG等[14]研究了161例乳腺癌组织和132例癌旁组织，免疫组织化学结果显示DCTPP1基因在癌组织中过表达，且在细胞核中的表达浓聚，这与本课题组研究结果一致，DCTPP1基因与肿瘤密切相关。

本课题组分析1 070例乳腺癌患者的总体生存时间后发现高表达DCTPP1基因的乳腺癌患者总体生存时间明显缩短，MORISAKI等[15]在对胃癌干细胞的蛋白组学进行比对分析后研究发现DCTPP1基因的活化转移可能与胃癌干细胞中DNA的复制相关，并发现DCTPP1基因的高表达与胃癌患者的预后不良有关。LU等[16]在前列腺癌中也有同样的发现，提示DCTPP1基因与乳腺癌、前列腺癌、胃癌的不良预后相关，提示DCTPP1基因可能是肿瘤患者预后不良因素。

REQUENA等[17]探究了DCTPP1基因在细胞核苷酸同源性中的作用,研究了这种酶的广泛表征,发现该酶在细胞核、细胞质和线粒体中普遍存在,在正常细胞代谢过程中,DCTPP1基因可催化dCTP水解成dCMP，从而将dCMP池维持在胸苷酸合成的水平。dCTP/dTTP的适当比例对于维持核苷酸库中生理稳态十分重要。DCTPP1基因在细胞中的活性可能参与核苷酸库中dCTP浓度的调节，影响细胞内核苷酸库中dCTP/dTTP 的比例。现有研究显示NTP-PPase细胞代谢过程中的消除异常的核苷酸，发挥着“清理门户”功能[3]。XIA等[5]随后在对胃癌中的研究发现高表达的DCTPP1基因通过对MDRl的去甲基化作用促进了胃癌对化疗的耐药性。通过与DCTPP1基因相关的蛋白进一步探究DCTPP1基因的功能发现，此类蛋白广泛分布于细胞各个结构中，参与细胞的代谢生长过程，蛋白结合过程。LU等[16]研究发现过表达DCTPP1基因促进前列腺癌肿瘤细胞的生长。REQUENA等[18]在对人宫颈癌细胞株Hela的研究发现DCTPP1基因可增加化疗药物的抗肿瘤活性。王佳琦等[19]研究证实雷公藤可以直接与DCTPP1基因相互作用，抑制DCTPP1基因酶的活性从而干预肿瘤的发生。

综上所述，DCTPP1基因在乳腺癌组织中高表达，且与乳腺癌患者不良预后相关，可能参与了乳腺癌发生发展过程，对该基因进一步研究可协助评估患者预后并为乳腺癌的治疗提供新的干预靶点。