LXRβ调节海马突触可塑性改善APP/PS1小鼠认知功能的研究*

万腾飞，吕 彦，刘 亮△

(北部战区总医院：1.干一科；2.神经内科，沈阳 110016)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病，主要表现为渐进性记忆和认知功能障碍及神经精神症状[1]。AD早期的病理改变主要表现为淀粉样蛋白的沉积(β-amyloid，Aβ)、神经纤维缠结和突触的丢失。既往研究表明，通过促进AD小鼠的突触形成可有效改善认知功能[2]。而成对免疫球蛋白样受体B(paired-immunoglobulin-like receptor B，PirB)能作为Aβ的受体，使丝切蛋白去磷酸化并活化，导致突触的丢失和可塑性的降低[3]。肝X 受体(liver X receptor，LXR)包括 LXRα和 LXRβ两型，属于配体激活的核转录因子，研究表明中枢神经系统中的内源性LXRβ活化能够有效调节脂代谢、神经炎症及突触可塑性[4]。然而，LXRβ能否通过PirB调节海马突触可塑性来改善AD小鼠的认知功能障碍目前尚缺乏报道。本研究采用经典的APP/PS1转基因AD模型小鼠，通过给予LXRβ激动剂，检测对APP/PS1转基因小鼠学习记忆功能的改善作用，并探讨LXRβ对PirB的影响和对海马组织突触形成的调节作用与机制，旨在为治疗AD引起的学习认知障碍提供治疗靶点，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂

LXRβ激动剂T0901317(美国Sigma公司)、PirB抗体(美国R&D公司)、β-actin抗体(英国Abcam公司)、Synapsin抗体(英国Abcam公司)、PSD-95抗体(英国Abcam公司)、生物素二抗(美国Life Technologies公司)等。

1.1.2实验动物

20只APP/PS1转基因AD模型小鼠及10只同窝野生(wild-type，WT)小鼠购于南京模式动物中心，9个月龄，雄性，所有实验小鼠饲养在温度与湿度适宜的洁净环境中，自由摄食，分笼饲养。所有动物实验按照实验动物管理及保护的有关规定进行。

1.2 方法

1.2.1实验分组与药物处理

WT小鼠作为对照组(WT组，n=10)，APP/PS1双转基因小鼠分为AD组(AD组，n=10)和T0901317处理组(AD+T0组，n=10)。其中AD+T0组小鼠采用灌胃给予50 mg/kg的T0901317，连续处理14 d，WT组和AD组给予同等剂量的二甲基亚砜(DMSO)溶剂。

1.2.2新物体识别实验

参考文献[5]的方法，对小鼠进行新物体识别行为学检测。具体操作如下：先将两个完全相同的圆柱形物体(A物体)分别放在测试箱的两侧，放入小鼠让其在箱内适应3 min，再让小鼠休息15 min，进行测试阶段，将一侧的圆柱形物体换为立方体盒(B物体)，立方体盒底面边长与之前的圆柱体盒直径一样，然后将待测试小鼠放入测试箱中，让其自由探索3 min，采用Ethovision XT软件记录并分析小鼠探索新物体及旧物体的时间，即鼻尖距离物体边缘小于2 cm，探索偏爱指数=小鼠探索新物体的时间(B)/小鼠探索所有物体的总时间(A+B)×100%。

1.2.3水迷宫行为学实验

参考文献[6]的方法，对小鼠进行Morris水迷宫行为学检测。具体操作如下：在正式进行行为学检测的前1 d，将所有小鼠进行适应性训练，消除不同实验组小鼠对各个象限的探索偏爱。接着对所有小鼠进行4 d正式的实验训练，将小鼠放入水中，让小鼠游泳找到隐藏的平台，总共限时60 s，若在60 s以内未能找到平台，则将小鼠放到平台上，小鼠每次在平台上停留20 s，记录小鼠每次找到平台的潜伏期。第5天将平台撤去，检测小鼠对平台象限的记忆水平。每次试验进行60 s，记录小鼠找到正确象限的潜伏期，并记录小鼠在60 s内进入正确象限的总次数。

1.2.4免疫组织化学检测

小鼠行为学检测结束后，对小鼠进行灌注，取材，将脑组织利用4%及30%蔗糖溶液进行脱水固定后，进行冰冻切片。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)对小鼠脑切片进行漂洗，加入一抗兔抗-离子钙结合衔接分子-1(Iba-1)，放入4 ℃冰箱中孵育12 h，再用0.01 mol/L PBS进行漂洗后，加入生物素二抗，在37 ℃孵箱中反应3 h，再用0.01 mol/L PBS进行漂洗，加入SABC溶液放入到37 ℃孵箱中反应1 h，漂洗后采用DAB溶液进行显色，贴片，采图。统计海马组织中Iba-1阳性细胞数，并计算出Iba-1阳性细胞数的密度，每组共采用4个标本进行检测，以此反映小胶质细胞数量。

1.2.5Western blot检测

取材后，将小鼠脑组织置于冰上分离出海马组织，加入组织裂解液，用组织破碎机对海马组织进行研磨，离心后取上清液。利用BCA试剂盒对各标本的蛋白浓度进行测定。按照说明书上的流程配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳凝胶，加入蛋白样品进行电泳，接着采用湿转法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%的脱脂奶粉溶液对PVDF膜进行封闭3 h，漂洗后分别加入对应的抗体，在4 ℃条件下孵育12 h，采用TBST清洗后，分别加入对应的二抗，在37 ℃条件下反应2 h，漂洗后加入发光液，用Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像系统显影采图。最后利用ImageJ软件对各条带上的灰度值进行分析，并以β-actin为内参计算出成对免疫球蛋白样受体B(PirB)、海马突触相关蛋白Synapsin和PSD-95相对表达水平。并以WT组为参考，分别算出各组目的蛋白的相对表达水平，每组共采用4个标本进行检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 T0901317对AD小鼠认知功能的影响

新物体识别行为学检测发现，AD组存在短时记忆的障碍，表现为对新物体的探索偏爱指数明显低于WT组，而AD+T0组对新物体的探索偏爱指数明显提升(P<0.05)。Morris水迷宫行为学检测发现，在第5天测试阶段，AD组在目标象限停留时间百分比明显低于WT组(P<0.05)，AD组同时进入目标象限的次数也明显低于WT组(P<0.05)。而AD+T0组在目标象限停留时间百分比及进入目标象限的次数明显增加(P<0.05)，见图1。

A：小鼠进行新物体识别实验对新物体的探索偏爱指数；B：Morris水迷宫实验中小鼠在目标象限停留时间所占的百分比；C：Morris水迷宫实验中各组小鼠进入目标象限的次数;a：P<0.05，与WT组比较；b：P<0.05，与AD+T0组比较。

2.2 T0901317对AD小鼠海马组织Iba-1阳性细胞数的影响

免疫组织化学检测发现，AD组海马组织Iba-1阳性细胞数比WT组多(P<0.05)，而AD+T0组海马组织Iba-1阳性细胞数明显降低(P<0.05)，见图2。

A:WT组小鼠海马组织Iba-1免疫组织化学染色图；B：AD组小鼠海马组织Iba-1免疫组织化学染色图；C:AD+T0组小鼠海马组织Iba-1免疫组织化学染色图；D：3组小鼠海马组织Iba-1阳性细胞密度统计图;a：P<0.05，与WT组比较；b：P<0.05，与AD+T0组比较。

2.3 T0901317对AD小鼠海马组织PirB、Synapsin和PSD-95表达水平的影响

Western blot检测发现，与WT组比较，AD组海马组织PirB表达水平升高，Synapsin和PSD-95表达水平降低(P<0.05)，而AD+T0组PirB表达水平降低，Synapsin和PSD-95表达水平明显升高(P<0.05)，见图3。

A：Western blot检测；B：小鼠海马组织PirB半定量分析 C:小鼠海马组织Synapsin半定量分析；D:小鼠海马组织PSD-95半定量分析,a：P<0.05，与WT组比较；b：P<0.05，与AD+T0组比较。

3 讨 论

AD是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。AD患者最早表现出的临床症状为海马相关的记忆丢失，是突触功能异常的结果。使用功能磁共振成像(fMRI)在体脑成像技术，发现与记忆相关的脑区往往形成异常的网络联系[7]。采用电子显微镜进行超微结构观察发现AD患者海马区域突触丢失明显，且这种突触丢失的严重程度与记忆减退的程度明显相关[8]。BERTONI-FREDDARI等[9]证实AD小鼠海马组织平均单个神经元的突触数较非AD对照组减少50%。AD患者脑组织内突触相关蛋白(Synapsin和PSD-95)的丢失与AD患者认知功能减退的程度密切相关[10]。采用免疫组织化学与免疫印迹分析表明AD患者脑组织中突触前蛋白与突触后蛋白较同龄非AD对照组明显降低，亦提示这些特异的突触蛋白参与AD病的进程[11]。同样，在AD动物模型中观察到AD早期的病理改变主要表现为淀粉样蛋白的沉积和突触的丢失。此外，通过将胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植入AD模型大鼠内能分化为神经元并与靶区神经元建立了突触，并检测到学习记忆得到改善[12]。因此，对AD中突触功能调控机制研究为AD治疗提供重要途径。本研究结果提示，LXRβ激动剂T0901317可以通过调节AD小鼠海马组织的突触可塑性来改善认知功能。

LXR包括 LXRα和 LXRβ两型，属于配体激活的核转录因子。其中LXRα主要分布在与脂代谢相关的组织与细胞如肝脏、小肠、脂肪组织等，LXRβ在体内有更广泛的表达。研究资料显示LXR在中枢神经系统发育中亦有重要功能，其中LXRβ为主要的亚型表达受体。中枢神经系统中内源性LXRβ活化能够有效调节脂代谢与炎性反应[13]。当脑组织的炎症使疾病加重时，小胶质细胞会过多活化产生严重的神经毒性[14]。已有研究表明，LXRβ能通过核因子-κB(NF-κB)通路来减少AD小鼠中的星形胶质细胞形成，从而防止胆碱能神经元被损伤[15]。同时，LXRβ能够促进小胶质细胞对脑内的Aβ蛋白的清除[16]。在本研究中，也进一步证实了，LXRβ激动剂T0901317可以明显降低AD小鼠海马组织的Iba-1阳性细胞数，从而抑制脑内的过度炎性反应。

PirB是存在于小鼠体内和人类白细胞免疫球样蛋白受体B2(human leukocyte immunoglobulin-like receptor B2，LILRB2)同源的一类膜蛋白受体。起初发现，在免疫系统中PirB在B淋巴细胞、肥大细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突细胞中表达，能作为主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)的受体来调节免疫反应[17]。近期研究发现，PirB表达在中枢神经系统的神经元和星形胶质细胞中，在中枢神经系统损伤后，PirB的表达水平增高，且能通过和轴突抑制生长因子Nogo、OMgp和MAG的相互作用来抑制轴突的生长和神经元的可塑性[18-19]。此外，PirB的突变鼠，在视神经损伤后对比对照组，表现出极强的视皮层的可塑性[20]。最新研究发现，在AD小鼠中，PirB能作为Aβ的受体，使蛋白磷酸酶PP2A和PP2B上调，从而使丝切蛋白去磷酸化并活化，活化的丝切蛋白使肌动蛋白丝解聚，最终导致突触的丢失和可塑性的丢失[3]。本研究也进一步发现，通过活化内源的LXRβ可以降低AD小鼠海马组织PirB的表达水平，同时上调突触相关蛋白的表达，进而改善AD小鼠的认知功能，提示LXRβ可能通过PirB调节AD小鼠海马的突触可塑性，进而改善记忆和认知功能障碍。

综上所述，本研究证实了LXRβ激动剂激活内源性LXRβ会对AD所致的突触损伤有一定的修复作用,并能改善AD小鼠的记忆和认知功能障碍。该研究可为治疗AD提供新的靶点，并提供干预的措施以缓解AD引起的记忆和认知功能障碍，为临床治疗AD患者提供新的药物可能。