盲肠不同部位结扎穿孔致脓毒症模型的建立研究*

王圆圆，陈 晴，赵 晗，王婧蓉，何长江，叶小利

(西南大学生命科学学院，重庆 400715)

脓毒症是指由感染引起的全身炎性反应综合征，是烧伤、创伤、感染、休克等临床急危重患者的严重并发症之一，其发生率、病死率均较高。脓毒症可进一步发展为重症脓毒症、脓毒症休克、多器官功能障碍综合征(MODS)[1-2]。有调查显示脓毒症已成为重症监护病房仅次于心脏病的主要死亡原因[3]。研究发现脓毒症的发病机制、病理生理机制是十分复杂的，不仅包括宿主、免疫、炎症及凝血功能异常等多个方面，同时还涉及许多器官及系统，也包括信号通路的参与。尽管已有许多文献研究、临床病理深入观察，但其作为一种失调的免疫过程，一系列炎性反应、凝血功能障碍的发生，阻碍了提升救治水平、降低死亡率的进展。因此，积极寻找针对性措施阻止病情的进一步发展，深入探讨脓毒症发生、发展的病理生理机制是极重要的。

盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)被认为是进行脓毒症研究的金标准[4]，CLP模型已有30多年的应用历史,是研究脓毒症潜在机制的理想模型[5],主要优点是能够诱导不同严重程度的脓毒症[6]。现有证据表明，炎性反应随着脓毒症的严重程度而变化，这在很大程度上取决于盲肠结扎的程度[1,7]。本实验拟通过对小鼠进行不同程度的CLP，以诱发不同严重程度的脓毒症，比较其病理变化程度，并对手术操作步骤进行改良，分析诱导脓毒症的标准化程序，综合评估更符合临床病理过程的脓毒症模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

无特殊病原体(SPF)级KM雄性6周龄小鼠50只，体重35～42 g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供。小鼠平衡饲养5 d，饲养于西南大学药学院SPF级动物实验中心[SYXK(渝)2014-0002]。饲养条件：温度23～24 ℃，湿度(50±10)%，12 h光照/黑暗循环，自由饮水摄食。ELISA试剂盒[肿瘤坏死因子-α(TNF-α，SU-BN20852)、白细胞介素-6(IL-6，SU-BN20188)]购于福建省泉州市睿信生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1实验分组

实验分5组：空白对照(NC)组，假手术(Sham)组，以及根据盲肠的结扎部位分为轻度脓毒症(Min)组、中度脓毒症(Mod)组和重度脓毒症(Sev)组，每组10 只；NC组不做任何处理，Sham组仅行开腹、关腹程序。

1.2.2手术方法

用10%水合氯醛麻醉小鼠，使用脱毛膏/电动修剪器剃掉小鼠腹部的毛，并用75%乙醇及聚维酮碘消毒该区域。在腹白线靠右切开腹腔约2 cm，找出盲肠后用 5-0 缝线分别结扎盲肠的不同位置(图1)：Min组盲肠结扎程度为1/3(图2A)、Mod组为1/2(图2B)、Sev组为2/3盲肠(图2C)，以21G 针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。为确保通畅，用消毒镊子适度挤压让微量肠内容物从穿刺孔溢出；将处理好的盲肠回纳入腹腔，缝合内层用5-0缝线，闭合外层用3-0 缝线，见图3。在15 min内完成每只小鼠的手术流程。待小鼠苏醒后自由饮水，正常饲养，并观察记录小鼠生理状况。

图1 盲肠结扎部位示意图

A:Min组;B:Mod组;C:Sev组。

A:麻醉并脱毛;B:切开腹腔;C:找出盲肠;D:盲肠结扎;E:穿孔;F:缝合。

1.2.3观察指标

(1)评估24 h内小鼠临床症候、生存状况；(2)各组死亡率比较；(3)解剖小鼠肝脏及盲肠组织，苏木素-伊红(HE)染色观察形态变化；(4)24 h后进行小鼠眼眶取血，检测炎性因子水平，包括TNF-α、IL-6。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组临床症候观察

NC组：反应敏捷，精神、食欲、大小便均正常，毛发均匀光泽。Sham组：苏醒后精神较好，小鼠大多舔舐伤口，能自由进行取食、饮水等活动。Min组：苏醒时间与假手术组相差不大，醒后身体蜷缩，基本不活动，进食减少，进水频率较高，对外界反应较迟钝，呼吸频率加快，大部分小鼠扎堆取暖，排便部分呈现黏着状态。12 h后没有小鼠死亡，20 h后小鼠开始死亡，24 h后死亡率约20%。Mod组：苏醒延迟，醒后精神萎靡，身体蜷缩，基本不活动，进食、进水减少，大便稀软，体温明显降低，小部分小鼠扎堆取暖。12 h内有部分小鼠死亡，12 h后小鼠死亡数目增多，24 h后死亡率约40%。Sev组：所有小鼠不再扎堆取暖，12 h内死亡率达90%。剖腹可见恶臭味血性渗液，肠管水肿粘连，盲肠坏死变黑。

2.2 各组死亡率比较

24 h内,盲肠结扎程度为1/3的Min组，其死亡率约为20%；盲肠结扎程度为1/2的Mod组，死亡率为40%；盲肠结扎程度为2/3的Sev组，小鼠死亡率为90%。Min组的致死高峰期相比于Mod组，会在更晚期出现，Sev组的死亡高峰集中于前12 h。

2.3 HE染色结果分析

光镜下结果显示，NC组小鼠盲肠组织、肝组织形态正常，组织纤维结构排列紧密；Sham组小鼠与NC组差异不大。Mod组小鼠盲肠组织结构有严重损伤，出血和细胞坏死脱落，白细胞浸润，肠部黏膜水肿，细胞边界模糊；肝脏组织结构被破坏，出现急性炎症损伤，微血栓、淤血及空泡脂肪样变性，少数细胞有轻微水肿；病理变化程度Sev组最重，Min组最轻。结果显示，不同结扎部位皆能诱导小鼠感染脓毒症，且病变程度随着结扎程度的加深而加重，但Mod组效果呈现最为典型，见图4。

A、B:NC组小鼠盲肠组织;C:NC组小鼠肝脏组织;D、E:Mod组小鼠盲肠组织；F:Mod组小鼠肝脏组织。

2.4 各组炎性因子水平比较

与NC组比较，Sham组IL-6、TNF-α水平无明显变化(P>0.05)，Mod组IL-6、TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组炎性因子水平比较

3 讨 论

脓毒症及其引起的脓毒症休克和多器官衰竭病情凶险,会引发多系统功能障碍[8]，是ICU患者死亡的重要原因[9]。研究显示许多存活脓毒症患者合并不同程度的免疫抑制,机体表现出持续低水平炎性反应及进展性免疫抑制等免疫失衡状态[10]。

在脓毒症早期，为发挥对机体的保护作用，心、脑、肺、肝和肾等多个重要器官中自噬开始被诱导，后期随着免疫细胞功能抑制，机体进入持续的免疫抑制期。且研究发现，用自噬抑制剂来阻断自噬，则在脓毒症发病前期4～6 h，脂多糖诱发炎症加深，使得器官功能受损，呈现为组织器官损伤，也进一步导致小鼠死亡率升高。再者，脓毒症中出现机体自我防御的炎性反应，其中有重要的诱导促凝血作用的是多种细胞炎性因子[11]，其大量释放，通过促凝作用引起微循环障碍，造成脓毒症免疫抑制及功能紊乱，细胞因子分泌失调[1,7]。炎症诱导凝血反应，而凝血的激活又促进炎性反应，全身炎性反应则加重凝血激活和级联反应。脓毒症病发过程中，其释放的细胞因子转变为抗炎和促炎两大类，促炎细胞因子主要在早期脓毒症病理变化中产生，主要包括TNF-α、IL-2、IL-6等，抗炎介质有IL-4、IL-10、IL-13。其中TNF-α是炎症早期最主要的促炎细胞因子[12]，是内毒素损伤效应的关键介质，介导作用于凝血过程及相关通路变化[13]。IL-6是在其他炎性因子作用下产生的炎性介质，是促炎递质的核心成员。有研究表示，IL-6水平可以作为反映感染严重程度的指标，且直接与脓毒症的预后相关[14]。同时，在凝血过程中血小板的激活可以导致某一种配体CD40的释放，这种配体可促使IL-6合成增加，表明炎症通路的确立是脓毒症患者病理机制的关键。

本研究中，优化后的CLP脓毒症模型也存在缺点，即评价模型是否成功建立的指标比较局限[15]。传统的CLP手术步骤，对于针孔大小、结扎穿孔位置及程度等被证实决定最终死亡率的指标进行了标准化[16]，不同结扎穿孔的脓毒症模型虽皆能诱导小鼠感染脓毒症，且病变程度随着结扎程度的加深而加重，但Min组小鼠病变程度较低，Sev组小鼠病变程度较重，且病发速度过快，小鼠死亡率较高，检测急性炎性因子水平和验证模型成功率往往难以实现，故两者都难以对比模拟临床病症的真实情况。而Mod组效果明显，且小鼠病发速度可控，呈现状态最为典型，是进行脓毒症致病机制研究和抗炎药物筛选较好的动物模型。本实验虽探究了不同程度盲肠结扎穿孔的死亡率，但模拟临床脓毒症模型的建立还需在此基础上进一步探索，方便推广与应用。

本课题组对CLP的标准化手术流程进行改进，有以下2点总结：(1)传统CLP往往采用1～2 cm的中线缝合来完成手术，对于月龄较小、体重较小的小鼠易造成术中死亡或术后局部切口感染，小鼠死亡率由此增高。本项实验通过改变切口位置至中线偏右3～5 mm，使对盲肠进行操作时手术视野更优，从而缩小了手术切口。通过观察发现，手术切口越小，无关感染率越低，小鼠术后苏醒越快，而缩小后的手术切口所带来的弊端则是手术过程中盲肠组织难以被发现和进行手术处理，需要操作者仔细观察。同时，在实验操作中，发现因小鼠生理差异，存在少数盲肠末端位于腹腔左侧，压于组织器官之下，给实验操作带来极大难度，需要加大手术切口寻找盲肠位置，极易造成其他黏膜、组织出血或损伤。SOMMER等[17]曾对CLP小鼠模型的切口愈合状况进行了研究，发现在脓毒症模型组中，小鼠切口愈合能力下降，不仅使CLP术后伤口愈合时间延长，而且会影响远处伤口的愈合。因此，在脓毒症动物模型手术过程中，可在实验前通过光照对比，大致确定盲肠末端位置(光下呈明显灰黑色)后，在实验时缩小手术切口，集中于观测到的盲肠末端，可有效缩短实验时间，降低术后切口局部的感染风险。(2)严格控制实验时间，把握手术流程的标准化。掌握从剪开外皮至缝纫外皮耗时15 min，除必要的寻找盲肠、结扎穿孔需要耗费10 min，可通过减少缝纫小鼠外皮伤口的方法来缩短手术时间。已有研究显示可用金属伤口闭合夹进行外皮的闭合处理，故而在正式实验中，本实验对部分小鼠进行金属伤口闭合夹的试用，具体为术前用75%乙醇及聚维酮碘浸泡15 min，再进行内皮5-0 缝线缝纫、闭合外层用3-0缝线，结果发现能有效缩短手术时间至15 min内，同时减少了外皮缝合中可能出现的出血、感染情况。

综上所述，本研究采用CLP建立脓毒症小鼠模型，其中Mod模型是一种理想的动物模型。此外，通过炎性因子作用通路，分子对接表达也可以作为判断感染的指标之一，有助于脓毒症的诊断和治疗，为进一步靶向治疗脓毒症提供了新的研究方向。