不同方法提取胡萝卜中类胡萝卜素工艺研究

赵明德

(青海民族大学 生态环境与资源学院,青海 西宁 810007)

胡萝卜(学名：DaucuscarotaL.var.sativa Hoffm.)，又称红萝卜或甘荀，为野胡萝卜(学名：DaucuscarotaL.var.carota)的变种，本变种与原变种区别在于根肉质、长圆锥形、粗肥、呈红色或黄色.胡萝卜每100g鲜重含1.67～12.1mg胡萝卜素，含量高于番茄的5～7倍，在以胡萝卜为原料得到的产品中约含有60%的类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素为89.9%[1].我国北疆胡萝卜中类胡萝卜素含量高达10～45mg/100g[2].另外我国自行培育的93-8胡萝卜品种β-胡萝卜素达15～18mg/100g[3]，均有很高的开发价值.高等植物如胡萝卜、番茄、紫(白)苏、沙棘、火棘、西瓜、玉米等植物中也富含类胡萝卜素[4-7].类胡萝卜素还能通过微生物发酵获得[5-11].目前，中科院武汉病毒所、江苏微生物研究所、上海工业微生物所和上海化工研究院的发酵法生产β-胡萝卜素的技术已经成熟，可实现工业化生产[12].类胡萝卜素是食品、医药、饲料行业常用的一类色素，其中β-胡萝卜素、玉米黄素、辣椒红、辣椒黄、栀子黄等已被国家批准为食品添加剂[13-15].目前，大部分企业使用的β-胡萝卜素多数是化学合成产品[16].但随着医学毒理学和生物学试验工作的不断深入，人工合成的色素日益暴露出它的安全隐患，而天然类胡萝卜素安全性高，有的还具有营养保健价值[17-18]，故对天然类胡萝卜色素的需求量将日益增加.

类胡萝卜素具有很强的抗氧化性和消除氧自由基的能力，并且能诱导细胞间的连接通讯，调控肿瘤增殖等，具有抗癌、抑癌的作用[19]，同时类胡萝卜素还可提高动物繁殖能力，是一种生理抗氧化剂，可保护卵泡和子宫细胞免受氧化反应的破坏，有助于卵巢内类固醇的合成，改善子宫内环境，Brief和Chew[20]母猪注射β-胡萝卜素可使其受胎率提高12.5%，活仔数增加12.3%.植物角度研究表明，类胡萝卜素也是植物生存所必不可少的成分，它可以保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏，同时又是光合天线和反应中心不可缺少的结构成分，有些类胡萝卜素还是ABA合成的前体[21,22].从胡萝卜中提取类胡萝素相关研究很多，主要研究了有机溶剂提取胡萝卜中类胡萝卜素时，有机溶剂的选择和最优条件，还有超声波、微波和酶解等作为辅助处理时单个处理条件的最佳工艺条件.还没有对各种处理方法之间优劣比较，处理方法对提取类胡萝素产生差异的原因等的研究.本文取用青海大通的胡萝卜为实验材料，主要采用不同处理方法提取胡萝卜中的类胡萝卜素，并对不同的处理方法进行优缺点相关性分析，并采用柱层析色谱进行分离纯化，其工艺投资小，可为胡萝卜的深加工提供有力参考.

1 材料与方法

1.1 材料

材料：取新鲜黄色胡萝卜(产地青海大通)洗净用恒温鼓风干燥箱干燥至恒重，粉碎过40目筛.

试剂：类胡萝卜素标准品(上海纯优生物科技有限公司)、丙酮(分析纯)、石油醚(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、中性氧化铝(分析纯).

仪器及设备：722型可见分光光度计(上海)、电子天平FA1604N(上海箐海仪器有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(102型天津市实验仪器厂)、SHB-IIIA循环水式多用真空泵(深圳)、手提式组织粉碎机(上海)、超声波细胞粉碎机(上海)、格兰仕微波炉.

1.2 方法

1.2.1 类胡萝卜素的提取

取干燥的10g胡萝卜粉置于250mL锥形瓶中，加入石油醚和无水乙醇混合液，萃取得到的混合液用抽滤瓶抽滤，用石油醚洗涤3次，将所得滤液置于250mL分液漏斗中静置分层，加入20mL蒸馏水混匀静置分层，反复多次至下层无色，得到类胡萝卜素粗提液.

1.2.2 色谱柱的制备

在柱的最底层放入少量棉花，将石油醚—中性氧化铝悬浮液加入到10mm*160mm的层析柱中，边加边拍打柱体使氧化铝均匀沉积于柱内并保证上表面平整，加到10cm左右时在其上部铺一张圆形小滤纸，并将色谱柱固定在铁架台上.

1.2.3 类胡萝卜素含量测定方法和标准曲线的绘制

取一定量的胡萝卜素标准品用石油醚稀释，在波长200～800nm范围内，用TU-1901紫外可见分光光度计进行波谱扫描，测定胡萝卜素的最大吸收波长，作为胡萝卜素测定波长.结果显示，在波长450nm处有最大吸收峰.再精确称取胡萝卜素标准品5mg，用石油醚稀释定容到50mL容量瓶中，分别准确移取1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00mL定容至10mL在波长450nm处测定吸光度得表1，绘制标准曲线如图1.标准曲线的回归方程为：Y=0.0101X+0.013，相关系数为0.999.

图1 β-胡萝卜素吸光度标准曲线

2 结果与分析

2.1 单因素研究

2.1.1 不同料液比提取效果比较

称取5份相同质量干燥的胡萝卜粉(10g)，在其他条件相同的情况下，分别用料液比不同(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)的无水乙醇和石油醚混合液(1∶1)进行提取，得到的混合液稀释到500mL，用紫外分光光度计在波长450nm处测定各个吸光度.根据吸光度值的大小可以求出得率如图2所示，在料液比1∶10之后类胡萝卜素的得率变化很小，从降低提取成本考虑，1∶10的料液比是最佳的提取条件.

图2 料液比对类胡萝卜素提取的影响

2.1.2 不同浸提时间提取效果比较

称取5份相同质量的胡萝卜粉(10g)，在其他条件相同的情况下，分别用无水乙醇和石油醚混合液(100mL)进行提取，提取时间分别为30min、60min、90min、120min、150min，得到的混合液稀释到500mL，用紫外分光光度计在波长450nm处测定各个吸光度.根据吸光度值求出得率如图3.在90min时达到最大提取量，90min后由于有机溶剂的挥发，时间过长有机溶剂使类胡萝卜素降解等因素使得率下降.由此可得90min提取时间是有机溶剂浸提法最佳的提取时间.

图3 浸提时间对类胡萝卜素提取的影响

2.1.3 不同浸提温度对提取效果的影响

图4 浸提温度对类胡萝卜素提取的影响

称取5份质量相同的干燥胡萝卜粉(10g)，在其他条件相同的情况下，加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，在恒温水浴锅中分别放置在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下浸提，提取得到的混合溶液稀释到500mL，用紫外分光光度计在波长450nm处测各个吸光度.根据吸光度值求出得率如图4所示，随着温度增高分子运动剧烈，目标产物扩散速率越大，溶解度增大，提取率增加，在30～40℃下类胡萝卜的得率最高，当温度高于40℃石油醚挥发过快同时温度升高色素降解使得率下降.

2.2 正交试验结果及主效应分析

根据单因素实验结果，选择提取料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)进行3因素3水平正交试验(见表2)，固定提取溶剂石油醚与乙醇混合液和原料粉碎细度(40目)，试验结果及数据处理结果如表3所示.

表2 正交因素水平表

由极差分析可知，RC>RB>RA，故影响因素次序为C>B>A，即提取温度的影响最显著，其次是提取时间，最后料液比.最佳提取条件组合为A1B3C3，即提取时间120min、提料液比1∶10、取温度40℃.

表3 正交实验结果

2.3 不同辅助条件提取类胡萝卜素分析

2.3.1 超声波破碎时间对提取类胡萝卜素影响

称取5份质量相同的干燥胡萝卜粉(10g)，在其他条件相同的情况下，加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，在超声波下分别处理10min、15min、20min、25min、30min，提取得到的混合溶液稀释到500mL，用紫外分光光度计在波长450nm处测各个吸光度.根据吸光度值求出得率如图5，在超声处理25min条件下得到最大得率11.13mg/10g，25min之前由于处理还不充分，所以得率较低，25min后由于温度的变化及溶剂挥发等因素影响导致得率降低.

图5 超声破碎时间对类胡萝卜素提取的影响

2.3.2 微波破碎时间对类胡萝卜素提取影响

称取5份质量相同的干燥胡萝卜粉(10g)，在其他条件相同的情况下，先加入少量蒸馏水使其充分浸湿，然后在微波功率480W分别处理10s、20s、30s、40s、50s，取出加入石油醚和乙醇的混合溶液料液比1∶10，提取得到的混合溶液稀释到500mL，用紫外分光光度计在波长450nm处测得各个吸光度.根据吸光度值求出得率如图6，在30s时类胡萝卜素得率最高，30s后由于微波破碎升温较快，温度超过60℃使类胡萝卜素分解，同时也因为温度过高导致微波破碎提取法的类胡萝卜素得率最低.

图6 微波破碎时间对类胡萝卜素提取的影响

3 讨论

3.1 不同提取方法分析比较

有机溶剂法提取胡萝卜素是当前主要的天然类胡萝卜素提取方法，虽然方法简单但提取率不高.本试验考虑采用微波和超声波作为辅助条件提高类胡萝卜素的提取率.在微波辅助提取时，类胡萝卜素的得率为8.71mg/10g，类胡萝卜素的得率反而将低.由于微波作为提取辅助条件时温度无法控制，导致处理时间长，温度过高使类胡萝卜素分解得率下降；处理时间短，作用不够充分类胡萝卜素析出的量少，类胡萝卜素的得率很低，说明微波提取不利于类胡萝卜素的提取.超声波作为辅助条件时类胡萝卜素得率达到11.14mg/10g，得率明显提高，超声波破碎易于控制温度，同时细胞的破碎率较高，利于细胞内物质析出，作为辅助条件有利于类胡萝卜素的提取.

3.2 柱色谱分离中洗脱剂的使用

将提取得到的混合液在恒温水浴锅60℃下蒸发，至体积为5mL左右，加入到制备好的色谱柱中，先用石油醚洗脱得到明黄色洗脱液，再用3∶7丙酮与石油醚混合液洗脱得到橘黄色洗脱液，再用1∶1丙酮与石油醚混合液洗脱得到青黄色洗脱液.经本试验验证是最理想的洗脱剂使用方法.

4 结论

有机溶剂提取法最佳工艺参数为体积比1∶1石油醚和无水乙醇的混合液作为提取剂，提取时间120min，提取温度40℃，料液比1∶10，类胡萝卜素得率为8.98mg/10g.采用微波破碎和超声波破碎作预处理时，30℃水浴中超声破碎最佳时间为25min，得率为11.14mg/10g，微波破碎在功率480W时最佳时间30s，得率为8.71mg/10g.经验证性试验验证，超声波辅助提取时其类胡萝素得率最高，可以用于实践.而微波辅助提取时其类胡萝卜素得率较低，不适合应用于胡萝卜的类胡萝卜素提取工艺.