亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性及相关代谢物与内耳疾病的关系

宋颖慧，索利敏，董美，范林静，白瑞，李赟，李强，赵长青

(1.山西医科大学,山西 太原 030001； 2.山西医科大学第二医院 耳鼻咽喉头颈外科,山西 太原 030001; 3.山西医科大学第二医院 中心实验室,山西 太原 030001)

内耳疾病指各种致病因素引起耳蜗前庭功能受损，临床表现为听力下降、眩晕、耳鸣等，常见有突发性聋、感音神经性聋、梅尼埃病、前庭功能障碍、耳鸣等，大多数病因及发病机制不清，内耳微循环损伤被认为是其重要病理生理机制。大量研究发现亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因多态性是血管及细胞功能损伤的遗传危险因素。MTHFR催化5，IO-亚甲基四氢叶酸还原成5-亚甲基四氢叶酸，基因多态性会使此关键酶活性下降，导致叶酸缺乏、高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血症等，进一步损伤血管细胞功能。本研究分析内耳疾病患者与健康体检者MTHFR基因多态性、血清Hcy及血清叶酸结果，探讨相互关系，为内耳疾病机制研究、预防及临床诊治提供指导依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019年4月—2019年11月山西医科大学第二医院住院进行内科治疗的内耳疾病患者175例作为疾病组，其中男84例，女91例；年龄38～65岁，平均年龄(51.35±14.22)岁。主要症状以听力下降和眩晕、头晕、耳鸣为主，统计疾病组患者的一般资料、MTHFRC677T基因多态性检测结果、血清Hcy及血清叶酸水平结果，并将根据病因及临床诊断分为突发性聋(sudden sensorineural hearing loss，SSHL)组80例、梅尼埃病(Meniere’s disease，MD)组36例、感音神经性聋(sensorineural hearing loss，SHL)组18例和前庭功能障碍(vestibular dysfunction，VD)组41例。选取同期的健康体检者175例作为对照组，其中男92例，女83例；年龄38～64岁，平均年龄(52.64±11.40)岁。两组均排除严重心血管疾病、妊娠期妇女、中枢神经系统疾病、中耳疾病、耳解剖结构异常、耳良恶性肿瘤、头部耳部外伤史、中耳内耳手术史等。两组的年龄、性别分布差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 实验方法

MTHFR基因检测方法为抽取抗凝外周血，进行DNA提取，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增后，采用焦磷酸/毛细管电泳测序平台对MTHFR基因常见突变位点(rs1801133)进行基因测序。采用双试剂循环酶法检测血清Hcy水平，血清Hcy浓度升高>15 μmol/L为异常；血清叶酸浓度<10 nmol/L为异常。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 基因型及等位基因分布频率比较

MTHFRC677T基因检测产生3种基因型，分别为CC、CT和TT,其中CT、TT均属于突变型。疾病组基因型结果为CC 21例(12.0%)、CT 104例(59.4%)、TT 50例(28.6%)，对照组为CC 35例(20.0%)、CT 93例(53.1%)、TT 47例(26.9%),两组均进行Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，符合遗传平衡(P>0.05)，均具有群体代表性。两组基因型总体分布差异无统计学意义(P>0.05)。各基因型频率比较，疾病组CC型频率低于对照组，突变型频率(CT+TT)高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；CT型、TT型频率均略高于对照组(P>0.05)。疾病组等位基因频率为C(41.7%)和T(58.3%),对照组为C(53.4%)和T(46.6%)，两组等位基因分布差异具有统计学意义(P<0.05)，疾病组C频率低于对照组，T频率明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2 MTHFR基因多态性与内耳疾病发生风险

突变型(CT+TT)发生内耳疾病的风险是CC的1.397倍(OR=1.397，P<0.05)，风险增加39.7%。其中CT是CC的1.408倍(OR=1.408，P<0.05)，风险增加40.8%，TT是CC的1.375倍(OR=1.375，P>0.05)，TT是CT的0.976倍(OR=0.976，P>0.05)。等位基因T发生内耳疾病风险是C的1.264倍，增加26.4%(OR=1.264,P<0.05)。见表2。

2.3 各组内耳疾病MTHFR C677T基因型及等位基因分布

将疾病组分为SSHL组80例、MD组36例、SHL组18例和VD组41例。各组与对照组相比，基因型总体分布差异均无统计学意义(P均>0.05)；除SHL以外，其余各组等位基因C、T分布差异具有统计学意义，T频率高于对照组，C频率低于对照组(P均<0.05)。各基因型频率比较，MD组CC频率低于对照组，突变型(CT+TT)频率高于对照组，差异具有统计学意义(P均<0.05)；SHL组TT频率低于对照组(P<0.05)。其余两组各基因型频率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、4。

2.4 各组内耳疾病的发病风险估计

突变型(CT+TT)发生MD的风险是CC的3.615倍(OR=3.615，P<0.05)，风险增加2.615倍，其中TT是CC的4.476倍(OR=4.476，P<0.05)，CT是CC的3.138倍(OR=3.138，P>0.05)，TT是CT的1.426倍(OR=1.426，P>0.05)。见表5。等位基因T突变发生SSHL、MD、VD的风险分别是C的1.329倍(OR=1.329，P<0.05)、2.11倍(OR=1.329，P<0.05)、1.676倍(OR=1.676，P<0.05)。见表6。

表1 MTHFR基因C677T位点的基因型分布频率及等位基因分布频率 [例(%)]

表2 MTHFR基因C677T基因多态性与内耳疾病发生风险关系 (例)

表3 各分类疾病MTHFR基因C677T位点的基因型分布 [例(%)]

表4 各分类疾病MTHFR基因C677T位点的等位基因分布 [例(%)]

表5 MTHFR C677T基因型与MD发生风险关系 (例)

表6 MTHFR C677T等位基因与各组内耳疾病发生风险关系 [例(%)]

2.5 血清Hcy与内耳疾病、MTHFR基因多态性的关系

疾病组血清Hcy平均浓度(12.78±9.44)μmol/L高于对照组的(11.18±4.64)μmol/L，差异无统计学意义(P>0.05)，但疾病组血清Hcy异常38例(21.7%)高于对照组23例(13.1%)，差异具有统计学意义(P<0.05)。疾病组各基因型中血清Hcy平均浓度均高于对照组，并在TT型中差异具有统计学意义(P<0.05)。见表7。

2.6 内耳疾病中血清Hcy、叶酸情况

疾病组中不同基因型间血清Hcy浓度及异常率存在差异(P均=0.000)；其中TT 型血清Hcy浓度(17.62±13.22)μmol/L高于CT 型(10.93±6.60)μmol/L、CC 型(10.43±6.35)μmol/L，CT 型高于CC 型，差异均有统计学意义(P均<0.05)；TT 型Hcy异常23例(46%)高于CT型13例(9.29%)、CC 型2例(9.52%)(P均<0.05)，CT型Hcy异常13例(9.29%)低于CC 型2例(9.52%)(P>0.05)；CC型发生Hcy异常的风险分别是CT、TT型的0.762倍(OR=0.762，P>0.05)、0.207倍(OR=0.207，P<0.05)，CT型是TT型的0.272倍(OR=0.272，P=0.000)。叶酸平均浓度(16.67±10.17)nmol/L，异常率26.9%，各基因型间均差异无统计学意义(P>0.05)。见表8、9。

3 讨论

目前内耳疾病发生机制尚不明确，但其微循环损伤仍是重要的病理生理基础。内耳具有独特的循环特点，血供主要来自迷路动脉，到达内耳分为3支，分别供给前庭、半规管及耳蜗。这些动脉沿途分出众多辐射状小动脉，形成复杂的终末血管网，走形极度扭曲，无侧枝循环，直径小且血流速度缓慢，甚至仅允许单个红细胞通过，极易导致循环损伤。当各种致病因素损伤内耳微循环时，可以影响内耳功能细胞代谢及内淋巴稳态，导致内耳听觉平衡功能受损，内耳疾病发生。

MTHFR基因多态性是近年来发现的常见遗传性血管危险因素，与H型高血压、脑梗死、冠心病、深静脉血栓等血管性疾病密切相关。MTHFR基因位于1p36.3号染色体上，有11个外显子，研究最多的多态性位点是第4号外显子677位(C677T,rs1801133)，该位点的碱基胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置换，从而使编码的丙氨酸被缬氨酸替代，直接影响 MTHFR 酶功能，表现为不同程度的酶活性和耐热性降低。MTHFR是叶酸和Hcy代谢的关键酶，其催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原成5-亚甲基四氢叶酸。后者参与血中Hcy甲基化生成甲硫氨酸，以维持血Hcy水平，为核酸、蛋白质合成和甲基化提供甲基供体。酶活性降低可能引起低叶酸、高Hcy血症、核酸合成和甲基化的异常，进一步损伤血管与功能细胞。C突变T后产生3种基因型，分别为 CC型(野生型)、CT型(杂合突变型)、TT型(纯合突变型)，其中 CT 型酶活性降低 65%，TT 型降低30%[1]。

表7 两组血同型半胱氨酸水平及异常情况比较 [例(%)]

表8 内耳疾病患者 MTHFR C677T位点各基因型血清同型半胱氨酸、血清叶酸情况

表9 各基因型间血清同型半胱氨酸两两比较

目前对MTHFRC677T多态性与内耳疾病的关系研究存在较大争议。Capaccio等认为MTHFR基因多态性与SHL[2]、SSHL[3-4]存在相关性，可成为发病的危险因素，并参与相关的血管损伤。Uchida[5]、Gross[6]、Hamidi[7]等支持上述观点，并认为此基因突变与其他遗传性因素(MTHFR A1298C、ApoE等)共同作用于内耳，或是一个独立于血叶酸和Hcy的危险因素[5]。也有学者持否定观点，认为MTHFR基因多态性与SSHL之间无关联[6-11]。在其他内耳疾病上，Uchida[12]、Manche[13]等发现MTHFRC677T纯合TT型与老年性听力损伤显著相关，增加了老年聋的风险。Yang等[14]发现MTHFRC677T和A1298C多态性与MD风险相关，并认为C677T多态性是MD的保护因素，这可能与多态性导致的细胞内高水平5,10-亚甲基四氢叶酸盐有关，可防止DNA合成过程中核苷酸的不平衡，确保DNA复制的高保真度。但只在叶酸含量较高时保护作用明显[15]。

本研究中疾病组CC型频率低于对照组，CT+CT型频率高于对照组(P<0.05)，具有统计学意义，CT型、TT型均略高于对照组，表明MTHFRC677T基因多态性与内耳疾病具有一定相关性。发病风险估计显示MTHFR C677T基因突变可增加内耳疾病发生风险，其中CT型、TT型分别是CC型的1.408倍(P<0.05)、1.375倍(P>0.05)，而TT型是CT型的0.976倍(P>0.05)，相比较而言，CT型更易患内耳疾病。在等位基因层面，T等位基因在不同人群中差异很大，在地中海或亚洲的许多民族中超过30%[16]。在中国汉族人群中，则呈由南向北逐步升高的趋势，在海南最低 (24%)，其次是湖北(40.3%)和江苏(43.5%)，在山东观察到最高频率(63.1%)[17]。本研究中疾病组T基因频率为58.3%，与我国其他地区相比，突变率处于高值，且明显高于对照组(46.6%)，使内耳疾病发生风险增加0.264倍(P均<0.05)，进一步证明MTHFRC677T多态性与内耳疾病密切相关，T等位基因可成为内耳疾病的危险因素。而一项Meta分析发现在欧洲人群中MTHFRC677T多态性与SSHL显著相关，而亚洲人群中无相关性[18]。张乐[11]也发现山东汉族人SSHL组与对照组在MTHFR基因型与等位基因分布无显著差异，这可能与地域、种族差异等有关。MTHFR基因多态性也存在性别、年龄等差异，Pollak等[19]发现在男性患者中，MTHFRC677T与听力损失程度呈剂量依赖性相关，且在对Hcy的影响中，男性比女性更明显。而在本研究中尚未进行性别、年龄分组研究，有待于进一步深入。

MTHFR基因多态性可独立或协同低叶酸、高Hcy等血管危险因素作用于内耳。Capaccio 等[4]证明了MTHFR突变与SHL之间显著相关，并发现两组的Hcy、叶酸水平有显著统计学差异，进一步支持MTHFR突变与SHL微血管损伤的关系。Fusconi 等[20-21]发现SSHL高Hcy血症与MTHFRC677T纯合突变有关，认为SSHL是由这两个变量共同作用的结果。在本研究中，两组血清Hcy异常率存在显著差异(P<0.05)，各基因型间血清Hcy浓度均高于对照组，并在TT型中具有统计学意义(P<0.05)，表明血清Hcy与内耳疾病、MTHFR多态性相关。疾病组中各基因型间血清Hcy水平和异常率均具有显著差异，且CC型发生Hcy异常风险分别是CT、TT型的0.762倍(P>0.05)、0.207倍(P<0.05)，CT型是TT型的0.272倍(P=0.000)，表明MTHFR基因多态性与血清Hcy关系密切，可增加血清Hcy升高风险，尤其基因型为TT型时，共同参与内耳疾病的发病机制，这与Fusconi 研究结果相似。未能发现MTHFR基因多态性与血清叶酸间的相关性(P>0.05)，可能与生活环境、饮食等因素有关。

一种内耳疾病中可能涉及多种病因及发病机制，本研究中根据病因及临床诊断将内耳疾病分类进一步研究，发现MD组中基因型CC频率低于对照组，突变型(CT+TT)频率高于对照组(P<0.05)，CT+TT型发生MD的风险是CC型的3.615倍(P<0.05)，其中TT、CT分别是CC型的4.476倍(P<0.05)，3.138倍(P>0.05)，同时等位基因C、T分布存在差异(P<0.05)，T突变使发生MD的风险增加1.11倍(P<0.05)，这些表明MTHFRC677T基因突变与MD关系密切，可明显增加MD发生风险，T基因可成为发病的危险因素，且TT型更易患梅尼埃病。这与Yang 等[14]研究结果相反。SSHL组和VD组各基因型频率与对照组比较无明显差异(P>0.05)，但等位基因T频率明显高于对照组，C频率低于对照组(P均<0.05)，T突变增加了两者的发生风险，说明MTHFR基因多态性与两者可能存在相关性，需进一步研究证明，临床上应予以关注。SHL组与对照组比较，等位基因分布无差别(P>0.05)，而基因型比较，TT型频率低于对照组(P<0.05)，可能是样本不足导致，此组中样本量小，TT型仅有1例。

MTHFRC677T基因多态性与内耳疾病相关，可作为危险因素或协同Hcy参与内耳病机制，对单一内耳疾病而言，MTHFR基因突变与MD关系密切，T基因突变也可能增加SSHL、VD的发生风险，故临床上应对此类人群予以关注，加强预防。但本研究存在一定的局限，有待于深入症状、年龄、性别等分类研究，对MTHFR基因多态性与其他获得性或遗传性血管因素，如MTRR A66G、凝血酶原G20210A、各项凝血指标等关系进行研究，进一步探讨内耳疾病的发病机制。