改进后EROD 法与仪器分析法应用比对研究

刘 芸,赵 旭,胡小英,付建平,张素坤,任明忠

生态环境部华南环境科学研究所,国家环境保护环境污染健康风险评价重点实验室,广东 广州 510655

高分辨率气相色谱-高分辨率质谱法(HRGCHRMS 法)被誉为开展环境二英类污染物检测的“金方法”,具有高灵敏度、高分辨率等优点,但其成本高昂,难以开展高频次、大范围的推广应用,影响到了二英分析测试的常态化[6]。 生物检测方法具有操作便捷、费用低廉,且能通过各种代谢活化酶类的作用模拟人体真实情况等优点,受到了越来越多的关注[7-9]。 常见的生物检测方法有酶活力诱导法(7-乙氧基-3-异吩恶唑酮-脱乙基酶 法, EROD 法)[10]、 荧 光 素 酶 报 告 基 因法[5,11-13]、酶免疫分析法[14-15]和荧光免疫分析法[16]等。 美国食品与药品管理局(FDA)利用EROD 法进行食品中二英的检测[17];日本环境省把基于芳香烃受体(AhR)的二英生物报告基因监测方法和使用二英作抗原的抗原体反应方法设定为废物焚烧炉所排放二英的检测方法[17];我国也已开展了大量关于二英类污染物生物检测方法的研究[7,11,18-20]。

针对上述问题,本研究开展了以下工作:一是优化前处理方法,对传统EROD 法的样品前处理过程进行改进,提高回收率的同时,尽可能多地去除环境样品中可能存在的干扰物,即非二英类AhR 诱导活性物质,降低干扰物质的影响;二是利用同一环境样品、相同前处理过程,计算生物检测法与仪器分析法测定结果的一致性,了解生物实验材料自身与环境样品中的二英类污染物反应的有效性;三是开展应用实例,采集不同地区垃圾焚烧厂飞灰样品,采用改进后的生物方法进行检测,评估将生物检测法作为仪器分析法的替代方法进行推广的可行性,为加强环境中二英类污染物的监测与监管提供数据参考。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

实验仪器:氮吹仪(上海秉越,BYN100),二氧化碳培养箱(美国Thermo,6500),生物安全柜(新加坡ESCO,AC2-S),高分辨气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent,7890A-5975C),全波段酶标仪(美国Biotek,Synergy HT),台式高速冷冻离心机(美国Thermo,Biofuge Primo R),电子天平(德国Sartorius,BS224S)。

实验试剂和材料:大鼠肝细胞瘤H4-ⅡE 细胞系(中国医学科学院基础医学研究中心),DMEM 细胞培养基、血清、胰酶、7-乙氧基-异吩恶唑酮(ERF)、2,3,7,8-四氯代二苯-并-对二英(2,3,7,8-TCDD)、试卤灵(RF)(美国Sigma),异丙醇、DMSO、正己烷(北京化学试剂公司,分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集和预处理

飞灰样品的采集和储藏参考《工业固体废物采样制样技术规范》(HJ/T 20—1998)和《海洋监测规范 第3 部分:样品采集、贮存与运输》(GB 17378.3—2007)。 用干净的不锈钢采集装置采集一定量的飞灰样品,随后用锡箔纸包好放入密封袋中,低温环境下送回实验室风干、破碎、过筛,然后进行样品前处理。

实验样品为我国南部地区3 家垃圾焚烧厂的飞灰,编号分别为KW2、KW4 和FH2。 取40 g 飞灰样品,盐酸(2 mol/L)浸泡0.5 h,滤纸滤干,用大量去离子水冲洗,滤干并冷冻干燥后,采用甲苯索氏抽提法对样品抽提48 h。

1.2.2 EROD 法检测

1.2.2.1 样品净化

将抽提浓缩后的样品依次通过:多段硅胶柱,用正己烷进行洗脱;氧化铝-弗罗里硅土复合柱,用正己烷-二氯甲烷(体积比95 ∶5)洗脱;凝胶渗透色谱柱,用正己烷-二氯甲烷(体积比1 ∶1)洗脱。 收集洗脱液,旋转蒸发浓缩。

1.2.2.2 转溶

1.2.2.3 检测

将生长良好的大鼠肝细胞瘤H4-ⅡE 细胞按每孔2×105个接种到96 孔板中,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h 后,弃去培养液。 取无菌洁净EP 管,先加入995 μL DMEM(添加胎牛血清与双抗)培养液,再加入5 μL 前处理后的待测样品,涡旋混匀,按照每孔100 μL 添加于96 孔板中。 每个培养板中添加 DMSO 溶剂对照及2,3,7,8-TCDD 阳性对照,每个待测样品和对照均设置4 个平行孔。 72 h 后取出96 孔板,弃去溶液,加入100 μL 新鲜配制的含1 μL 1 mmol/L ERF 和0.1 μL 10 mmol/L 双香豆素的DMEM 培养液,于CO2培养箱中反应60 min 后,加入130 μL 甲醇终止反应,室温下混匀。 取100 μL 混合液于酶标板中,用酶标仪测定反应终产物RF 的荧光强度,激发波长设为535 nm,吸收波长设为590 nm。 将96孔板中剩余的反应液吸出,加入NaOH 溶液破碎细胞。 细胞破碎后,吸出100 μL 弃掉,再加入200 μL考马斯亮蓝(G250)染液,反应10 min,用酶标仪在595 nm 吸收波长处测定蛋白吸光值。

1.2.2.4 标准曲线绘制

1)RF 标准曲线。 配制一组浓度范围为0 ～200 nmol/L 的RF 溶液,在535 nm 激发波长和590 nm 吸收波长下,用酶标仪测定其荧光值,建立荧光值与浓度之间的线性关系,从而将测得的荧光值转换成RF 的量(nmol/L)。

2)蛋白标准曲线。 配制一组浓度范围为0 ～500 mg/mL 的牛血清白蛋白溶液,加入G250 染液200 μL,反应10 min 后,在595 nm 波长处测定吸光度,建立吸光度与蛋白浓度的线性关系,从而计算样品中的蛋白含量(mg)。

3)2,3,7,8-TCDD 标准曲线。 以离体的大鼠肝细胞瘤H4-ⅡE 细胞为实验材料,用浓度为0.005 ～200 μg/L 的2,3,7,8-TCDD 标准溶液进行暴露实验。 在535 nm 激发波长和590 nm 吸收波长条件下,测定反应终产物RF 的荧光强度和蛋白质含量,绘制荧光强度与2,3,7,8-TCDD 浓度之间的剂量-效应曲线,并计算相应的半数有效浓度(EC50)。 酶活关系曲线由以下Logistic 方程用最小二乘法进行拟合:

式中:Y 为EROD 活性;X 为2,3,7,8-TCDD 浓度,即诱导剂量;A 为最大EROD 活性;B 为回归曲线中线性区段的斜率;C 为导致半数最大EROD 活性时的2,3,7,8-TCDD 标准溶液浓度,即EC50;D为最小EROD 活性。

1.2.3 HRGC-HRMS 法检测

1.3 数据处理和分析

HRGC-HRMS 法测得的毒性当量(TEQ)是由17 种多氯代二苯并二英/呋喃(PCDD/Fs)异构体的实测值与世界卫生组织订立的毒性当量因子(WHO-TEF)相乘得到的,17 种PCDD/Fs 异构体的TEQ 之和为样品中二英类物质的总毒性当量浓度(后文用WHO-TEQ 表示)。

将样品酶活性代入2,3,7,8-TCDD 标准曲线,计算得到样品的2,3,7,8-TCDD 毒性当量(后文用Bio-TEQ 表示)。

所有数据均采用Excel 2003、SPSS 19.0 进行处理与统计分析, 采用 Explore 统计过程和Kolmogorov-Smimov 检验确认数据是否呈良好的正态分布,采用独立样本t 检验或ANOVA 进行平均值显著性差异检验,显著性水平设为P＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 EROD 标准曲线绘制及Bio-TEQ 计算

图1 和图2 分别为RF 浓度和蛋白浓度的标准曲线,其线性回归系数分别为0.999 9 和0.999 7。由图1 和图2 可知,在检测浓度范围内,RF 浓度与荧光值、蛋白浓度与吸光值之间具有极好的线性关系。

图1 RF 浓度标准曲线Fig.1 Standard curve for resorufin analysis

图2 牛血清蛋白标准曲线Fig.2 Standard curve for bovine serum protein

在进行样品检测时,EROD 活性用样品中RF 的值除以蛋白含量和反应时间表示[pmol/(min·mg)]。利用标准诱导物2,3,7,8-TCDD 诱导的EROD 活性作剂量-效应关系标准曲线(图3)。

图3 2,3,7,8-TCDD 诱导的EROD活性剂量-效应标准曲线Fig.3 Standard dose-effect curve of EROD activity induced by 2,3,7,8-TCDD

根据2,3,7,8-TCDD 诱导的EROD 活性剂量-效应关系标准曲线得出,EC50为0.49 μg/L,检测区间为0.05 ～10 μg/L。 该EC50与SHEN 等[24](0.45 μg/L)、冯忠孚等[21](0.75 μg/L)的研究结果处于同一个数量级,说明本研究建立的检测体系与其他研究的研究结果具有良好的可比性。 综上,RF 浓度标准曲线、蛋白浓度标准曲线和EROD 活性剂量-效应关系标准曲线均符合检测要求,检测数据可靠,适用于二英类物质的检测。

2.2 飞灰样品中二英的回收率

本研究进一步开展了对生物检测方法前处理过程的改进工作,尽量消除样品中的非二英类污染物对检测结果的影响,再探究其与仪器分析法的可比性。

表1 不同前处理方式下飞灰样品中二英的回收率Table 1 Recovery rate of dioxins in fly ash with different pretreatment %

表1 不同前处理方式下飞灰样品中二英的回收率Table 1 Recovery rate of dioxins in fly ash with different pretreatment %

注:“a”“b”“c”中,对于同一样品,不同字母表示不同前处理方式的检测结果之间存在显著差异。

检测指标 样品 EP-DMSO EP-Mix 梨形烧瓶-Mix KW2 36.70a 64.41b 74.16c PCDD/Fs KW4 37.67a 61.11b 88.66c FH2 30.73a 40.59b 99.36c

2.3 飞灰样品中二英类物质的TEQ

采用细分前处理手段结合梨形烧瓶-Mix 前处理手段,利用EROD 法检测分析了我国南部地区3 家垃圾焚烧厂飞灰样品中的二英类物质水平,同时采用HRGC-HRMS 法对相同样品进行了检测。 如表2 所示,EROD 法和HRGC-HRMS 法检测得到的同一飞灰样品中PCDD/Fs 的TEQ 无显著差异。 将检测数据与不同研究团队采用生物检测法与仪器分析法测定的环境样品二英类污染物含量数据进行比对。 从表3 可以看出,采用传统生物检测法测得的检测值普遍高于仪器分析法,且不同方法的检测数据之间存在显著差异,说明本研究所采用的改进后前处理过程能够消除样品中的干扰物质对检测结果的影响,其检测结果与仪器分析法的检测结果具有良好的可比性,采用生物检测法替代仪器分析法检测二英类污染物已成为可能。

表2 飞灰样品二英检测结果Table 2 Dioxin detected results in fly ash ng/kg

表2 飞灰样品二英检测结果Table 2 Dioxin detected results in fly ash ng/kg

注:对于同一样品,“a”表示不同检测方法的检测结果之间无显著差异。

检测物 样品 WHO-TEQ Bio-TEQ KW2 1.65a 1.52a PCDD/Fs KW4 1.92a 2.09a FH2 0.175a 0.173a

表3 样品中二英类物质的TEQTable 3 Toxicity equivalent quantity of dioxin in samples

表3 样品中二英类物质的TEQTable 3 Toxicity equivalent quantity of dioxin in samples

注:“a”“b”中,对于同一样品,不同字母表示不同检测方法的检测结果之间存在显著差异,相同字母表示不存在显著差异。

检测物 样品 Bio-TEQ WHO-TEQ 参考文献飞灰1/(ng/kg) 1 020.45a 921.17a [27]PCDD/Fs飞灰2/(ng/kg) 845.78a 738.69a [27]沉积物/(ng/kg) 5.4a 1.6b [28]土壤/(ng/kg) 1.8a 0.1b [28]土壤/(ng/kg) 1 480a 1 300a [29]土壤1/(ng/kg) 146 a 48 b [23]沉积物1/(ng/kg) 76 a 32 b [23]焚烧废气1/(pg/m3) 12.1 a 2.5 b [21]焚烧废气2/(pg/m3) 18.7a 9.7a [21]废气/(ng/m3) 2.7a 2.5a [22]

3 结论