北京郊区长角血蜱携带立克次氏体、泰勒虫的分子检测

王 业 ， 张庆勋 ， 李 英 ， 袁国辉 ， 韩姝伊 ， 何宏轩

(1.中国科学院动物研究所 , 北京 朝阳 100101 ； 2.青海大学农牧学院 ， 青海 西宁 810016)

蜱是一种体表寄生的吸血性节肢动物，广泛分布于世界各地，对人类及动物健康存在较大威胁。全球约有近900种蜱，我国已知的蜱类有130余种，包含硬蜱科的7属120余种和软蜱科的3属10余种[1]。有超过28种蜱能引起多种人类疾病[2]。此外，蜱类还可作为多种病原体(细菌、病毒和原生动物)的传播媒介和储存宿主，可以携带和传播多种病原体，除引起人和动物过敏反应、刺激和皮肤损伤外[3-4]，还可引起人与动物的梨形虫病(Piroplasmosis)、立克次氏体病(Rickettsiosis)和无形体病(Anaplasmosis)，对全球人类和动物都具有重要的意义[4-5]。长角血蜱(Haemaphysalislongicornis,H.longicornis)属于硬蜱科的一种，广泛分布于世界各地[2]，在我国大部分地区均有分布，也是北京地区的优势蜱种，是人类和动物疾病的重要载体，可以携带无形体属(Anaplasmaspp.)、埃立克体属(Ehrlichiaspp.)、巴贝斯属(Babesiaspp.)、螺旋体属(Spirochaeta)、柯克斯体属(Coxiella)和立克次体属(Rickettsiaspp.)等多种病原体[2]。王亚伟等[6]曾在北京的长角血蜱中检测出A.capra，尽管长角血蜱是北京地区的优势蜱种，但对于其携带的蜱传病原体的研究仍非常有限，为了解北京地区长角血蜱携带蜱传病原体的情况，本试验采用分子流行病学研究的方法对北京郊区的长角血蜱携带立克次氏体、无形体、梨形虫等情况进行调查，为北京地区蜱传疾病的防控提供科研和数据支持。

1 材料与方法

1.1 蜱虫样品的采集 2019年7月从北京市昌平区使用布旗法在草地上采集蜱样品共计134只。标记时间、地点、日期等信息，装入采蜱专用的10 mL离心管内，送回实验室进行蜱的形态学鉴定及基因组DNA的提取。

1.2 蜱的形态学鉴定 按照对蜱的描述，在体视显微镜下进行形态学鉴定，同时对蜱进行分类。

1.3 组织DNA提取 将分类后的蜱每5只分为一组，置于1.5 mL离心管中，以PBS洗涤，重复2次。之后使用75%酒精对蜱进行消毒，重复2次。然后弃去酒精，待晾干后用研钵将其组织磨碎，使用天根生化科技有限公司的血液/组织DNA提取试剂盒提取蜱的组织DNA。

1.4 PCR引物的合成 根据蜱的16S rDNA基因，参照文献[7]设计蜱种属鉴定的引物；根据梨形虫18S rRNA基因，参照文献[10-11]设计梨形虫鉴定的通用引物；根据立克次氏体OmpA基因，参照文献[12-13]设计立克次氏体鉴定的引物。所有引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物信息见表1。

表1 蜱种属及无形体、梨形虫和立克次氏体检测引物Table 1 Primers for identification of tick species, Anaplasma spp., Piroplasma spp.and Rickettsia spp.

1.5 蜱虫的分子鉴定 对经形态学鉴定为长角血蜱的蜱虫使用引物16S rDNA-F和16S rDNA-R对其16S rDNA基因进行扩增，采用50 μL的反应体系:2×TaqDNA 聚合酶25 μL，16S rDNA-F和16S rDNA-R各1 μL(10 μmol/L)，DNA 3 μL，补足水至50 μL。反应条件：94 ℃，5 min;94 ℃预变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸5 min。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，然后使用凝胶成像仪观察电泳结果，将符合目的条带大小的PCR产物经胶回收后送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

1.6 立克次氏体、梨形虫和无形体的分子鉴定 首先使用引物Piro1-S和Piro3-AS进行第1轮PCR反应，采用15 μL的反应体系:2×TaqDNA 聚合酶7.5 μL，Piro1-S和Piro3-AS各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 3 μL，加水补足15 μL。反应条件：94 ℃，5 min;94 ℃预变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min；待第1轮反应结束后，以第1轮的PCR产物为模版，使用引物PIRO-A1P和PIRO-B进行第2轮PCR反应，反应体系及反应条件同1.5，退火温度为55 ℃，对梨形虫进行检测。无形体使用引物EHR16SD和16S rDNA-R，立克次氏体使用引物Rr190.70和Rr190.701，按照表1的反应条件进行PCR，电泳及测序同1.5。

1.7 序列分析及系统发育树的构建 将测序得到的结果使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与NCBI数据库中的蜱虫、梨形虫以及立克次氏体序列进行同源性比对，然后利用软件MEGA 7.0中的Neighbour-Joining方法构建系统发育进化树，采用Bootstrap分析，绘图重复参数为1 000，分析遗传进化关系。

2 结果

2.1 蜱虫的形态学鉴定 从体型上可以看出该蜱为小型蜱，体色单一，有缘垛，假头基为四方形，呈矩形，第2节须肢向外伸展形成角突，无眼，盾板有色斑且分布均匀，基节Ⅱ～Ⅳ内距稍大，口下板齿式为 5/5，气孔板近似圆形，符合长角血蜱的特征。

2.2 蜱的分子鉴定 经PCR扩增和电泳鉴定后得到与蜱虫线粒体16S rDNA基因相符的约455 bp的目的片段，与预期大小相符(图1)。经BLAST比对，发现本试验鉴定的长角血蜱与河北(KJ710068)鉴定的长角血蜱的相似性最高，为99.74%，与江西(MG696723)的相似性最低，为98.30%，与河南(KX450305)和北京(KC203357)的相似性为99.48%，与湖北的相似性为98.43%。

图1 蜱16S rRNA基因的PCR扩增Fig.1 PCR detection of tick 16S rRNA geneM：DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1～12：样品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

2.3 无形体、立克次氏体及梨形虫的检测 经PCR扩增和电泳鉴定，所有样本的无形体检测均为阴性，有8个梨形虫样品的目的片段与梨形虫18S rRNA基因的大小相同，约430 bp(图2),阳性率为29.63%；得到的立克次氏体的目的片段有21个和OmpA基因的片段大小相符，阳性率为77.78%(图3)。经BLAST比对，发现本试验分离得到的梨形虫均为绵羊泰勒虫，立克次氏体为未定种。其中，绵羊泰勒虫与突尼斯(KM92442)在绵羊血液中检测到的相似度最高，为99.48%，与新疆(FJ603460)、伊朗(KX273858)和土耳其(KU714608)在绵羊中分离的相似率为98.98%。

图2 梨形虫18S rRNA基因的PCR扩增Fig.2 PCR detection of Piroplasma 18S rRNA geneM：DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1～12：样品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

图3 立克次氏体OmpA基因的PCR扩增Fig.3 PCR detection of Rickettsia OmpA geneM：DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1～12：样品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

2.4 系统进化分析 基于蜱虫的16S rDNA基因和绵羊泰勒虫的18S rRNA基因构建系统进化树，发现其与其他的长角血蜱聚集在同一分支，种群的遗传距离非常近(图4)，说明本试验所收集的蜱确为长角血蜱。根据绵羊泰勒虫的18S rRNA基因部分核苷酸序列进行系统发育分析，发现此次检测到的泰勒虫为绵羊泰勒虫(图5)。根据立克次氏体的OmpA基因部分核苷酸序列进行系统发育分析，得到如图6所示的系统进化树，发现分离到的立克次氏体和CandidatusRickettsiajingxinensis聚集在同一分支，说明此次分离到的立克次氏体为jingxinensis立克次氏体候选种(Ca.R.jingxinensis)。

图4 长角血蜱16S rDNA基因的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of H.longicornis 16S rDNA gene ▲:本试验获得的长角血蜱序列▲:Sequence of H.longicornis obtained in this study

图5 基于绵羊泰勒虫18S rRNA基因的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of T.ovis 18S rRNA gene▲:本试验获得的T.ovis序列▲:Sequence of T.ovis obtained in this study

3 讨论

本试验从北京市郊区获得的蜱为长角血蜱(H.longicornis)，在其体内检测出绵羊泰勒虫(T.ovis)和jingxinensis立克次氏体候选种共2种蜱传病原体，无形体在所有的样品中均未检出。从进化树中可以看到我国不同省份的长角血蜱的种群的遗传距离非常近，这与Jia等[2]的研究结果较为符合，说明长角血蜱的选择是为了分散，从而占据不同的生态系统，而不是为了地方竞争力。

随着分子生物学技术的发展，更多的立克次氏体不断被人们所发现，其中有些甚至可以引起人类感染。在20世纪30年代，俄罗斯远东地区有人感染立克次氏体西伯利亚亚种(Rickettsiasibiricasubsp)[14]，这是关于其最早的描述。自此，斑点热群(SFG)立克次体病陆续在俄国、中国和哈萨克斯坦被发现[15-16]。BJ-90是R.sibirica的亚种，1990年首次从我国的中华革蜱(Dermacentorsinicus)中分离出来，并于2013年和2016年分别在哈尔滨和北京的患者体内被分离出来，感染原因则是因为被蜱虫叮咬[17]。本试验中发现的Ca.R.jingxinensis为近年来发现的新种，目前已在多种蜱中被检出，有报道显示在人类中发现了一种属于Ca.R.jingxinensis的变种[18]。因此，尽管目前尚未证实其致病性，但仍应引起重视。T.ovis经常在蜱和小反刍动物中被检测到，其在绵羊体内感染率可以达到78%[19]。此外，在牦牛和藏羊中也有T.ovis感染的报道[20]。本试验是首次在北京地区的长角血蜱中检出T.ovis。泰勒虫病是一种由泰勒虫感染引起的重要的家畜传染病，在我国有20多个省市都有关于泰勒虫感染的报道[21]。除T.ovis外，T.luwenshuni和T.uilenbergi等多种泰勒虫都曾在山羊和绵羊中被报道[22]。另外，值得注意的是，虽然本试验未发现无形体的感染，但鉴于此前曾在北京的H.longicornis中检测出A.capra，此外，Anaplasmaovis和Anaplasmaphagocytophilum等无形体也都可以引起人类 感 染。如2009年的一项血清学调查显示，我国A.phagocytophilum的感染率为15.4%，其中农民受到感染的风险大大增加，然而，即使在城市居民中，也存在感染A.phagocytophilum的风险[23]。

图6 基于立克次氏体OmpA基因的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of Rickettsia OmpA gene ▲:本试验获得的立克次氏体序列▲:Sequence of Rickettsia obtained in this study

北京作为我国的首都，城区人口众多，郊区成为人们平时娱乐休闲的主要旅游去处。而郊区自然环境复杂，生态多样，这也增加了人们暴露的风险，进而有被蜱虫叮咬的危险，从而感染蜱传病。因此，应该加强对北京周边地区蜱的种类多样性及其携带病原体的流行病学调查，有关部门应该加强主动监测，防止人和动物被蜱叮咬而感染。