基于网络药理学探讨生脉散治疗快速性心律失常气阴两虚证作用机制

冉俊宁,陈朝阳,冯 君,刘建和

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007)

快速性心律失常(Tachyarrhythmia)是一组临床表现、起源部位、传导路径和预后意义很不相同的心律失常，临床上主要包括各种原因引起的过早搏动、心动过速、扑动和颤动等[1]。研究表明，全球的房颤住院负担呈现上升趋势[2-4]，另外室性心律失常所致猝死约占心脏死亡的50%[5-6]。西医治疗快速性心律失常费用较高且容易复发，又有致心律失常的风险，与西医相比中医治疗快速性心律失常有整体调节的作用，具有良好的临床疗效[7]。

中医根据快速性心律失常的临床表现，将其归属于“心悸”范畴，其病位主要在心，与肝、脾、肾、胃等诸多脏腑相关，病机分为虚、实两个方面，虚为气、血、阴、阳不足，心失所养；实为痰瘀、气滞、水饮扰心[1,8]。快速性心律失常气阴两虚证的病机可归纳为心气阴两虚，鼓动乏力，心失濡养，致心动失常，故临床常表现为心悸怔忡。而《医学启源》生脉散中以人参为君，性甘归心经，可大补元气，方能生津止渴；麦冬为臣，性甘寒归心经，可养阴生津，尚可清心除烦；佐以五味子酸收宁心，又可助人参固正，辅麦冬养阴[9-11]。三药并用，一补一润一敛，共奏益气生津、敛阴宁心之功。导师临床用其加减治疗快速性心律失常气阴两虚证疗效颇佳。本研究旨在通过网络药理学方法全面探究生脉散治疗快速性心律失常气阴两虚证可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 文献来源与分析平台 TCMSP数据库、Batman-TCM数据库；Pubchem数据库、Swiss target prediction数据库、Genecards数据库、String数据库、Cytoscape3.7.1软件、DAVID数据库、imageGP平台；Chemspider数据库、Uniprot数据库；Draw venn diagram平台。

1.2 研究方法

1.2.1 筛选生脉散活性成分信息：利用TCMSP数据库，以“北五味子”“人参”为检索词，以口服生物利用度(OB)≥30%、药物相似性(DL)≥0.18为筛选标准[12]，收集北五味子及人参的活性成分。利用Batman-TCM数据库，以麦冬拼音大写“MAI DONG”为检索词，以分数截止值(Score cutoff)≥20、P<0.05为筛选标准[9]，收集麦冬的活性成分。

1.2.2 收集活性成分相关靶点：将生脉散候选活性成分信息输入Pubchem数据库或Chemspider数据库获取活性成分的化学结构式，将不能在Pubchem数据库或Chemspider数据库获取到化学结构式的候选活性成分予以删除。将获取到的活性成分化学结构式输入Swiss target prediction数据库，以物种Homo Sapiens(智人)为标准，进行活性成分的靶点预测，删除无法预测到靶点的候选活性成分，利用Uniprot数据库对获取到的活性成分靶点名称进行规范。

1.2.3 快速性心律失常疾病相关靶点预测：在Genecards数据库中，以快速性心律失常英文名称“Tachyarrhythmia”为检测词，筛选得到快速性心律失常疾病相关靶点。

1.2.4 收集生脉散与快速性心律失常共同靶点：运用Draw venn diagram作图平台，将生脉散中北五味子、人参、麦冬活性成分的靶点及快速性心律失常疾病相关靶点进行映射取交集，以WWZ、RS、MD、Tachyarrhythmia分表代表北五味子、人参、麦冬、快速性心律失常，得到韦恩图及共同靶点信息。

1.2.5 共同靶点蛋白互作网络的构建：将获取到的共同靶点信息，录入至String数据库，以Multiple proteins、物种Homo sapiens(智人)、其他参数为默认值为标准[12]，构建共同靶点蛋白互作网络(PPI)，同时将PPI网络图相关信息利用Cytoscape3.7.1软件对PPI网络图相关信息进行可视化处理，再运用其Network analyzer功能对蛋白互作网络进行拓扑分析，得到共同靶点的Degree值。

1.2.6 共同靶点GO功能注释及KEGG通路富集分析：将共同靶点输入DAVID数据库，以“Official gene symbol”格式、Background为Homo sapiens标准进行GO功能注释及KEGG通路富集分析[12]，同时以P<0.05、Count=2为筛选标准[10]，分别导出生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)及KEGG通路富集分析相关数据进行处理，取Pvalue值负对数(NegLog10-Pvalue，lgP)得到lgP值，Pvalue值越小，则lgP越大，说明富集的程度越高。构建KEGG通路富集分析数据表格，利用imageGP平台对GO功能注释BP、CC、MF中富集程度前10位的数据及KEGG通路富集分析数据分别构建气泡图，同时将KEGG通路富集分析数据导入Cytoscape3.7.1 进行数据的可视化处理，构建靶点-通路网络图。

2 结 果

2.1 生脉散活性成分信息 在TCMSP平台收集到生脉散中北五味子、人参活性成分共320个，其中北五味子130个、人参190个，筛选条件后剩余活性成分30个，其中北五味子8个、人参22个。在Batman-TCM数据库运用筛选标准，收集到生脉散中麦冬活性成分22个。共得到活性成分52个，由表1可知，生脉散治疗快速性心律失常的主要活性成分有人参皂苷(Ginsenoside)、五味子乙素(Schizandrer B)、麦冬皂苷(Ophiopogonin)等。

2.2 生脉散活性成分与快速性心律失常疾病共同靶点信息 删除无化学结构式及靶点的活性成分，共预测得到生脉散活性成分相关靶点1672个，其中北五味子322个、人参700个、麦冬650个。利用Genecards数据库，对快速性心律失常进行检索，共得到与快速性心律失常相关的疾病靶点223个。将生脉散活性成分靶点信息及快速性心律失常疾病靶点信息输入Draw venn diagram平台，以WWZ、RS、MD、Tachyarrhythmia分别代表北五味子、人参、麦冬、快速性心律失常，取交集并绘制韦恩图后得到生脉散活性成分与快速性心律失常疾病共同靶点46个，韦恩图(图1)，具体共同靶点见表2。

表1 生脉散活性成分信息

2.3 共同靶点蛋白互作网络图及核心靶点信息 在String数据库中输入共同靶点相关信息后可得到生脉散活性成分与快速性心律失常共同靶点蛋白互作网络图(图2)。由图2可知靶点DSTYK、MT-ND4、NISCH、TNNI3K、GCK、RORA、JMJD2C、CAMK2G、FABP3无相互作用。利用Cytoscape构建PPI图，以Degree值设定节点大小，Degree值越大节点越大，靶点越重要；以 combined score值设定边线粗细，combined score值越大边线越粗(图3)。删除String中 PPI网络图9个无相互作用的靶点后，Cytoscape中 PPI网络图共有37个靶点，包括相互作用节点37个，相互作用关系82条，再利用Network analyzer功能，可得到46个共同靶点的Degree值，见表3。生脉散治疗快速性失常的重要靶点分别为：ACE、SRC、NOS3、ADRB2、AGTR1、HTR3A、ADRA1B、KCNH2等。

图1 生脉散活性成分靶点与快速性

表2 生脉散活性成分与快速性心律失常疾病靶点

图2 String中生脉散活性成分与快速性心律失常共同靶点PPI网络图

图3 Cytoscape中生脉散活性成分与快速性

表3 生脉散活性成分与快速性心律失常共同靶点Degree值信息

2.4 共同靶点GO功能注释结果 46个共同靶点通过DAVID进行GO功能注释后，共得到BP91个、CC18个、MF18个。取PValue值负对数得到-lgP值，-lgP值越大则富集的程度越高，对BP、CC、MF中高度居前10位的数据利用imageGP平台构建气泡图(图4)。由图可知生脉散活性成分与快速性心律失常共同靶点主要分布于细胞质膜、电压门控钙通道复合物、突触后膜、Z膜、轴突等细胞组分中，通过支架蛋白结合、离子通道结合、酶结合、药物结合、蛋白质酪氨酸激酶活化、ATP结合、缓激肽受体结合、α1-肾上腺素受体激活、钙依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活化、蛋白质异二聚活性等方式，参与正调控蛋白激酶B信号转导、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、调节血管收缩、调节钙离子运输、正调控ERK1和ERK2级联、肾素-血管紧张素对全身动脉血压的调节、通过心脏传导调节心率、对药物的反应、心脏传导、负调控钾离子转运等生物过程，从而发挥生脉散治疗快速性心律失常的作用。

2.5 共同靶点KEGG通路富集分析结果 46个共同靶点通过DAVID进行KEGG通路富集分析后，共得到19条信号通路，取Pvalue值负对后得到-lgP值，-lgP值越大则表明富集的程度越高，具体信号通路信息见表4。将KEGG通路富集分析数据利用imageGP平台构建气泡图(图5)。同时将KEGG通路富集分析数据导入Cytoscape进行数据的可视化处理，构建靶点-通路网络图(图6)。共同靶点主要富集在钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、VEGF信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、心肌细胞的肾上腺素信号转导通路、肾素-血管紧张素系统等19条信号通路上，表明生脉散主要通过调控以上通路发挥治疗快速性心律失常的作用。

图4 生脉散活性成分与快速性心律失常共同靶点GO生物功能注释气泡图

表4 生脉散活性成分与快速性心律失常共同靶点KEGG通路富集分析信息

图5 共同靶点KEGG通路富集分析气泡图

图6 生脉散活性成分与快速性心律失常

3 讨 论

本研究共得到生脉散活性成分52个，其中部分活性成分已被证实具有抗心律失常的作用。Lim等[13-14]、Mancuso等[15]、王巍等[16]研究发现，人参皂苷可维持心电图稳态，缩短ST段和QRS复杂间隔，抑制心肌缺血时T 波、ST 段、ST/R值的变化；Zhu等[17]、Shi等[18]、于晨[19]还发现其具有离子通道调节作用，可直接抑制心肌细胞内Ca2+通道，从而抑制心肌细胞内Ca2+超载，并改善心肌缺血期间心肌细胞中抗氧化酶的产生，明显降低心律失常发生率。心肌缺血、损伤或坏死是引起各类心律失常的重要原因。Zhao等[20]、Zhang等[21]研究表明五味子乙素可通过抑制氧化应激和诱导Akt磷酸化来减轻心肌损伤，并通过减少caspase-3的裂解来防止细胞凋亡。You等[22]、Huang等[23]发现麦冬皂苷D可通过上调CYP2

J3/EETs和抑制ER应激而在体外维持大鼠心肌细胞Ca2+稳态，并能抑制炎症、氧化应激和细胞凋亡，从而减轻大鼠心肌缺血-再灌注损伤。

通过Degree值预测到生脉散治疗快速性心律失常的重要靶点分别为ACE、SRC、NOS3、KCNH2等。血流动力学异常引起的心脏扩大会导致各种心律失常的发生，Bernstein等[24]研究发现ACE通过将血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ在血压调节中发挥作用，从而稳定血流动力学，预防心律失常的发生；肾素-血管紧张素系统由血管紧张素原、肾素、血管紧张素Ⅱ、Ang Ⅱ受体和血管紧张素转化酶组成，在维持正常的心血管功能中起关键作用，并导致一系列心血管疾病，例如高血压、冠心病、心肌炎、充血性心力衰竭等，而这些疾病又是引起各类心律失常的重要原因[25-26]。Callera等[27]的研究发现c-Src下调会减弱高血压的发展，改善内皮和心脏功能，降低氧化应激并使血管信号正常化，从而影响心律失常的发生。内皮功能障碍代表心血管危险因素相关的病理机制，而内皮功能主要基于内皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的功能和活性，氧化应激可通过对eNOS本身或上/下游信号转导分子中明确定义的“氧化还原开关”的不利调节而导致eNOS活性丧失，甚至导致酶的“解偶联”，导致心血管疾病的发生[28]。前期实验研究证实可通过降低KCNH2失活来治疗心律失常[29]。

GO功能注释表明，生脉散可能通过参与调控PKB/AKT信号转导、钙离子运输、钾离子转运等生物过程发挥治疗快速性心律失常的作用。通过干细胞移植治疗缺血性心律失常是一大研究热点，而PI3-K/Akt信号转导通路是骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的关键通路，前期研究[30]表明通过增加AKT的表达，可促进骨髓间充质干细胞量增殖。过多的Ca2+会导致早期后除极或延迟后除极，从而形成期前收缩或折返激动，诱发各类心律失常，前期研究[31]发现增强SERCA2a的活性可减少钙超载，从而治疗缺血性心律失常。低钾血症可通过抑制钾离子通道电导、Na+-K+-ATPase，促进细胞内Ca2+超载和CaMK激活，导致心律失常的发生；高钾血症的恶化可致心电图首先显示出由于总体动作电位时限缩短而导致的T波峰值，从而在整个心室壁上引起更多的同步复极，随后P波变宽并减小幅度，最终消失，QRS波变宽，严重的高钾血症可导致心脏传导阻滞，心搏停止[32]。

KEGG通路富集分析显示生脉散可能通过调节钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、VEGF信号通路、MAPK信号通路等抗心律失常。最常见的心律失常是房性心律失常，是由InsP3/Ca2+信号通路增加引起的[33]。广泛的促炎状态、内皮功能障碍、氧化应激所致的cGMP-PKG缺乏可能与射血分数保留的心衰有关[34]。研究发现，大鼠在发生心律失常30 min后可检测到VEGF-A表达和转录水平的升高[35]。MAPK在心脏的发育、功能、病理重塑和心律失常的发展中起着不可或缺的作用，其活性调节可促进心肌梗死后恢复并防止心律不齐的发展[36]。

综上所述，本研究利用网络药理学方法分析了生脉散治疗快速性心律失常气阴两虚证可能的作用活性成分、靶点及通路，初步揭示了生脉散抗快速性心律失常气阴两虚证可能的机制，为进一步进行实验及临床研究提供了理论依据及方向。但由于数据库及相关软件的局限性，仍需要在本研究基础上对于相关靶点及通路进行实验及临床研究进行验证。