丹酚酸对ADP诱导的血小板聚集的影响

李 红，张 云，付丙月，鲜 婧，张相军，王金虎，石海英

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

常见的心血管疾病有心脏病、高血压和脑血栓[1]。治疗血栓性心血管疾病，通常采用药物治疗，包括抗凝治疗，如肝素；抗血小板活化治疗，如阿司匹林；抗缺血治疗，包括β-受体阻滞剂、钙通道阻滞剂，血管紧张素转换酶抑制剂与汀类药物等[2]。已有研究表明，血管损伤破裂导致的血管内皮损伤，可激活血小板处于亢进状态，进而诱发血栓，因此，抗血小板聚集药物是治疗心血管疾病的有效手段[3]。

丹参是一种名贵的传统中药材，广泛用于多种疾病的预防和辅助治疗，如保护心脏，预防心脑血管疾病，抗氧化作用等[4]。复方丹参滴丸（CDDP）是一种广泛应用的传统药物，用于血栓性疾病的临床治疗，能促进血液循环和清除血瘀[5-6]。丹酚酸（salvianolic acid，SA，结构见图1）是丹参中有抗氧化作用的化合物之一，已有研究表明，丹酚酸有多种药理活性，包括抗氧化、保护血管内皮细胞、抗炎、抗肿瘤、保护肝脏和防止血栓形成等药理作用[7-8]。已有研究报道丹酚酸有高效的抗血小板作用，通过调节有抗血小板作用的聚集抑制分子cAMP而达到抑制血小板聚集的目的[9-13]。本文主要研究丹酚酸6种化合物体外对腺苷-5'二磷酸（adenosine-5-diphosphate，ADP）诱导的血小板聚集的作用，为后续研究提供依据。

图1 丹酚酸A（SAA）及其二相代谢物A1～A4及丹酚酸B（SAB）化学结构

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100 高效液相色谱仪，包括在线脱气机、自动进样器、二元高压泵和VWD检测器（美国安捷伦）；TGL-20W 台式高速冷冻离心机（湘仪仪器）；KQ5200E超声波清洗器（昆山市超声仪器）；移液枪（德国赛多利斯公司）；DK-98-1型电热恒温水浴锅（天津泰斯特）；普利生LBY-NJ4型血小板聚集仪（北京普利生）；飞鸽牌TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；血小板聚集仪配套设备（比浊杯，磁力搅拌子，墨盒，北京普利生）；一次性使用无菌注射器（新华安得）；MS105DU分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 药品与试剂

6种丹酚酸（均为本实验室自制，HPLC纯度＞90 %，SAA、SAB、A1、A2、A3、A4批号分别为20180101，20180102，20180103，20180104，20180105，20180106）；腺苷二磷酸（ADP，美国Sigma公司）；替格瑞洛（麦克林试剂）；水合氯醛（分析纯，国药集团化学试剂）；无水氯化钙，葡萄糖，生理盐水（山东鲁抗辰欣）；乙腈（Fisher Chemical）；其余试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。

1.3 实验动物

雄性健康清洁级SD大鼠，体重 220 g±20 g，由山东省药学科学院新药评价中心提供，审核合格。实验前饲养一周以适应环境。

2 方法

2.1 纯度测定

丹酚酸样品采用Agilent 1100高效液相色谱仪，采用YMC-Pack ODS-A-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温25 ℃，流动相为乙腈-0.01 %磷酸水（55:45），流速1.0 ml/min，检测波长263 nm，进样量20 μl，检测样品纯度。

2.2 富血小板血浆与贫血小板血浆的制备过程

取健康的雄性SD大鼠，体重约220±20 g，腹腔注射10 %水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉，经腹主动脉取血后，按抗凝剂与血液的容积比1:9加入3.8%枸橼酸钠，采血管与离心管等均用抗凝剂润管，轻轻摇匀，使抗凝剂与血液充分地混匀，防止其凝固。

采用一次离心法，于22 ℃、1500 r/min离心6 min，取上清即为富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP），其余标本以8000 r/min离心15 min，即为贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）。重复离心两次。将PRP与PPP均置于37 ℃，并加盖保存，时间不超过2 h。

2.3 血小板聚集率的测定

用贫血小板血浆调整富血小板血浆中的血小板数目为3×108个/ml，向已调好数目的300 μl富血小板血浆中加入2 mol/L无水氯化钙溶液40 μl，5 %葡萄糖溶液20 μl，20 μl空白溶媒，搅拌混匀，37 ℃保温5 min，用贫血小板血浆调零，加入 50 μl ADP诱导剂，其终浓度为50 μmol/L，以诱导血小板聚集，比浊法测定血小板聚集率，作为对照组。

取不同浓度的对照药物替格瑞洛及丹酚酸化合物代替上述空白溶媒，按上述步骤加到富血小板血浆中，检测血小板聚集率。检测结果用血小板最大聚集率表示。

3 结果与讨论

3.1 纯度结果

在给定的色谱条件下，采用乙腈-水体系，根据分离度和峰型等的差异，选择适当比例的流动相分离丹酚酸类化合物，结果见表1。测定结果表明，HPLC法专属性好灵敏度高，各化合物纯度均大于95 %，纯度检查符合实验要求。

表1 人参皂苷原型化合物纯度检查结果

3.2 血小板聚集实验结果

建立大鼠洗涤血小板体外模型，以ADP为诱导剂，替格瑞洛为阳性对照药，考察丹酚酸类化合物体外对血小板聚集的作用，采用比浊法测定其在5 min内的血小板聚集率，平行6次，结果用IC50表示。利用丹酚酸与血小板相互作用的评价体系，测定了阳性对照药物替格瑞洛的IC50值为1.9 nmol/L，与文献的报道值在一个数量级以内[3]，表明本实验所建立的评价系统稳定可靠。在相同的评价系统内，分别测定了6种丹酚酸类化合物与血小板的体外相互作用。结果见图2。

图2 丹酚酸对ADP诱导的体外大鼠血小板聚集作用的剂量反应曲线

如图2所示，6种丹酚酸类化合物对体外ADP诱导血小板聚集作用的剂量反应曲线在形状上没有显著区别，均呈剂量依赖性，且为正相关，即随着丹酚酸类化合物量的增加，其抑制血小板聚集的活性也同样增加。丹酚酸类化合物对血小板聚集的抑制作用表现出不同的作用程度，计算丹酚酸类化合物对血小板聚集抑制作用的半数抑制浓度（IC50值），用于定量表达其作用效力，见表2。由表2可见，丹酚酸对ADP诱导的体外大鼠血小板聚集作用的结果表明，IC50值为0.3～0.9 mmol/L，在mmol/L数量级上，抑制作用温和，推测其副作用较小，有研究价值。丹酚酸对ADP诱导的血小板聚集的效力不同，但抑制作用差别不大，推测可能与其化学结构有关，此处尚未进行其作用机制的分析与讨论。

表2 丹酚酸和替格瑞洛对ADP诱导的体外大鼠血小板聚集的影响

4 结论

本文建立了灵敏、快速、准确的体外血小板聚集评价系统，研究了丹酚酸等6种化合物对体外血小板聚集的影响，结果稳定可靠。结果表明，丹酚酸表现出中等的体外抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。丹酚酸对血小板聚集的抑制作用较温和，对于慢性病长期用药的治疗有一定意义，且有很好的研究价值。