高效液相色谱法测定不同产地白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量

（鹰潭市综合检验检测中心，江西 鹰潭 335000）

白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草的干燥全草，具有清热解毒、消痈散结、利水消肿等作用，广泛应用于毒蛇咬伤，咽喉肿痛，肺热喘咳，湿热黄疸，热淋涩痛，疮肿热痈等的治疗。白花蛇舌草的化学组分比较复杂，包括多糖、蒽醌类、黄酮类、三帖酸等多种化合物，其中去乙酰车叶草酸甲酯是其主要的有效成分，具有抗菌消炎、利水渗湿、保护肝脏、抑制多种恶性肿瘤细胞生长的作用，也有一定的抵抗诱癌致癌物的作用，此外还有更广泛的其他生物学效应[1-2]。本研究建立高效液相色谱法（HPLC）测定不同产地白花蛇舌草中去乙酰车叶草酸甲酯的含量，方法简便、重复性好、准确度高，可应用于白花蛇舌草的质量控制。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪（美国沃特世）；DS-3120超声波清洗器（天津东康）；MSA225PCE电子天平（赛多利斯）；去乙酰车叶草酸甲酯（中国食品药品检定研究院，批号111786-201602）；乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[3-10]

色谱柱：Waters SymmetryShield RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（4:96）；检测波长：236 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl；理论板数不低于6000（以去乙酰车叶草酸甲酯峰计）。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取去乙酰车叶草酸甲酯对照品16.75 mg，置25 ml量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，即制成0.67 mg/ml的对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取药材粗粉6 g，精密称定，加水煎煮2 h，煎液滤过，蒸干，残渣加甲醇溶解，分次转移至10 ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取白花蛇舌草样品，按2.2.2项方法制成供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，得样品的液相色谱图。结果见图1。

图1 HPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下对照品贮备液5，2.5，1.0，0.5，0.2 ml，分别置于10 ml量瓶中，用流动相定容，摇匀，按2.1项下色谱条件测定。以浓度（C）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程A=10 980C-24 969，r=0.9999。结果表明：去乙酰车叶草酸甲酯在13.4～335.0 μg/ml范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取含去乙酰车叶草酸甲酯的对照品溶液10 μl，按2.1项下色谱条件测定，重复进样5次，以乙酰车叶草酸甲酯的峰面积计算RSD值，结果RSD为0.6 %，表明精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取同一批江西产白花蛇舌草粗粉6份，每份6 g，按2.2.2项下方法制备，按2.1项下色谱条件测定，分别计算去乙酰车叶草酸甲酯的含量，结果平均含量为0.1288 mg/g，RSD为0.6 %，表明方法的重现性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批白花蛇舌草供试品溶液，分别于配制后0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定各时间点下去乙酰车叶草酸甲酯峰面积，并以去乙酰车叶草酸甲酯的峰面积计算RSD值。结果RSD为1.1 %，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 回收率试验 精密称取已知含量的白花蛇舌草粉末（过40目筛）6 g，共9份，分别精密加入去乙酰车叶草酸甲酯对照品溶液1.0，0.5，0.25 ml，再加水200 ml煎煮2 h，煎液滤过，蒸干，残渣加甲醇溶解，分次转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按2.1项下色谱条件测定，计算回收率。结果去乙酰车叶草酸甲酯的平均回收率为99.37 %， RSD为0.3 %，表明方法准确，见表1。

表1 回收率试验结果

2.4 样品测定

取不同产地的白花蛇舌草药材，按2.2.2项下方法处理，2.1项下色谱条件测定，计算去乙酰车叶草酸甲酯的含量，结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

3.1 波长的选择

采用DAD检测器3D模式进行全波长扫描，结果显示去乙酰车叶草酸甲酯的最大吸收波长是236 nm，因此确定其检测波长为236 nm。

3.2 提取方式的选择

考察了药材粗粉加水煎煮后蒸干用甲醇溶解直接过滤进样、药材粗粉加水煎煮后滤液用ADS-8大孔树脂洗脱后蒸干溶解进样、药材粗粉加水煎煮后滤液用HP-20大孔树脂洗脱后蒸干溶解进样等方式，结果显示药材粗粉加水煎煮后滤液直接蒸干再用甲醇溶解进样这种方式样品峰杂质少，成分较洗脱方式损失少，方法简单，成本低廉，是最佳的提取方式。

3.3 流动相的选择

考察了不同流动相甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、甲醇-水、乙腈-水对去乙酰车叶草酸甲酯的分离效果，结果乙腈-水作流动相峰形较好，分离度较高，且流动相简单，最终确定流动相为乙腈-水（4:96）。