东北刺人参总皂苷改善睡眠的作用及机制研究

于 爽，闫金铭，黄莉莉，罗煜婷，卞宏生，王艳艳，李廷利

（黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

东北刺人参（Oplopanax elatus Nakai），又名刺参，为五加科刺人参属的一种多年生药用植物[1]，其幼叶可食用，根茎部位常作药用[2]。东北刺人参的生长地区具有显著的地域特点，目前发现仅在俄罗斯远东地区、朝鲜北部山区和我国的吉林省长白山地区有其自然分布[3]，由于来源的稀少也被定为国家二类保护植物及吉林省一类保护植物。

现代药物化学研究显示东北刺人参具有多种活性物质，主要为多糖类、皂苷类、黄酮类、挥发油、不饱和脂肪酸等[4-5]。其药理作用也涉及神经系统、免疫系统、内分泌系统、心血管系统的多个方面。东北刺人参在临床上可用于治疗神经衰弱、失眠等症，动物实验也表明小鼠腹腔注射刺人参油乳剂，可出现安静、伏卧、眼睑下垂的表现。

本实验室前期研究中，初步确定了东北刺人参改善睡眠的有效部位为60 %乙醇洗脱组分，有效成分主要为皂苷类成分[6]，其改善睡眠作用与中枢神经递质含量有关[7]，但并未探究其改善睡眠的其他潜在机制。本研究结合以往实验结果，通过观察东北刺人参总皂苷对小鼠自主活动及小鼠翻正反射的影响，探讨其改善睡眠的作用。通过测定东北刺人参总皂苷对睡眠剥夺小鼠脑部海马、皮质、下丘脑中白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素4（IL-4）及白细胞介素10（IL-10）含量的影响，探讨其可能的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ZZ-6型小鼠自主活动仪（成都泰盟科技有限公司）；Synergy MX型酶标仪（美国Bio Tek公司）；XH-B型漩涡混匀器（美堰市康健医疗器具有限公司）；CT15E型低温离心机（日本日立公司）。

1.2 试药

东北刺人参，由吉林省集安市野生药材种植基地提供；地西泮片（山东信宜制药有限公司，批号：170101）；戊巴比妥钠（Sigma公司，批号：160R03257Y）；对氯苯丙氨酸（PCPA，Sigma公司，批号：MFCD00002601）；IL-1β ELISA检测试剂盒（美国R&D公司，批号：E20180301A）；TNF-α ELISA检测试剂盒（美国R&D公司，批号：E20180320A）；IL-4 ELISA检测试剂盒（美国R&D公司， 批号：E20180205A）；IL-10 ELISA检测试剂盒（美国R&D公司，批号：E20180210A）。

1.3 实验动物

ICR品系小鼠，SPF级，体重18～22 g，雄性。由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，实验动物许可证号码：SCXK（黑）2018-0004。实验动物饲养于独立通风动物房，温度24±2 ℃，湿度55 %±15 %，12:12 h明暗交替，实验动物可自由摄取食物和水。

2 方法

2.1 东北刺人参总皂苷的制备

称取一定量东北刺人参药材的根茎部，用10倍量的蒸馏水浸泡2 h，加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，滤过浓缩至折合生药1 g/ml。取D101大孔树脂进行预处理，用乙醇浸泡4 h后，用乙醇以2 BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊为止。将刺人参水煎液通过经预处理的D101大孔树脂，静态吸附3 h后以蒸馏水反复冲洗，直至用薄层色谱检测无糖显色，再用4 BV 30 %乙醇洗脱，最后用6 BV 60 %乙醇洗脱直至无皂苷显色。收集60 %乙醇洗脱液，减压回收，水浴蒸干，得刺人参总皂苷。

2.2 东北刺人参总皂苷对小鼠自主活动的影响

将50只小鼠随机分为空白组、刺人参总皂苷低、中、高剂量组及地西泮组，每组10只。其中实验药物组经灌胃途径给予刺人参总皂苷（150，300，600 mg/kg），空白对照组给予同体积蒸馏水，连续7 d。阳性对照组实验动物给予同体积蒸馏水，连续6 d，第7天灌胃给予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）。以上各组实验动物均于末次灌胃30 min后，放入自主活动测试仪内适应环境20 min。适应后，测定各组小鼠10 min内自主活动次数及站立次数。

2.3 东北刺人参总皂苷对阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠潜伏期、睡眠时间的影响

将60只小鼠随机分为空白组、刺人参总皂苷低、中、高剂量组及地西泮组，每组12只。其中实验药物组经灌胃途径给予不同剂量刺人参总皂苷，空白对照组给予同体积蒸馏水，连续7 d。阳性对照组实验动物给予同体积蒸馏水，连续6 d，第7天灌胃给予地西泮水溶液（2.5 mg/kg）。以上各组实验动物均于末次灌胃30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）。分别记录各组小鼠从注射戊巴比妥钠至翻正反射消失的时间及翻正反射消失的时间至翻正反射恢复的时间，即睡眠潜伏期及睡眠时间。

2.4 东北刺人参总皂苷对阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠发生率的影响

将36只小鼠随机分为空白组、刺人参总皂苷组及地西泮组，每组12只。给药组灌胃给予刺人参总皂苷（300 mg/kg），连续7 d，其他两组给药方式同前。各组实验动物均于末次灌胃30 min后，腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠（35 mg/kg）。以小鼠翻正反射消失为指标，记录30 min内各组入睡动物只数。

2.5 东北刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠睡眠影响的作用

将30只小鼠随机分为空白组、PCPA组及刺人参总皂苷+PCPA组，每组10只。刺人参+PCPA组实验动物经灌胃途径给予刺人参总皂苷（300 mg/kg）；空白组与PCPA组给予同体积蒸馏水，连续7 d。灌胃第5天，除空白组外的实验动物经皮下注射途径给予PCPA（350 mg/kg），空白组经皮下注射途径给予同体积的生理盐水溶液，连续 2 d。各组均于末次注射30 min后，经腹腔注射途径给予戊巴比妥钠50 mg/kg，记录各组实验动物睡眠潜伏期及睡眠时间。

2.6 东北刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠大脑海马、皮质、下丘脑中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响

将36只小鼠随机分为空白组、PCPA组和刺人参总皂苷组，每组12只。给药组经灌胃途径给予刺人参总皂苷（300 mg/kg），空白组及PCPA组给予同体积的蒸馏水，连续7 d。在灌胃第5天，除空白组外的实验动物经皮下注射途径给予PCPA（350 mg/kg），空白组经皮下注射途径给予同体积的生理盐水溶液，连续 2 d。各组实验动物末次注射30 min后，断头取脑，分离海马、皮质、下丘脑。用冰生理盐水将各部分脑组织匀浆后，取上清，待测。采用酶联免疫法，测定小鼠海马、皮质、下丘脑中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10的含量。

2.7 统计分析

3 结果

3.1 东北刺人参总皂苷对小鼠自主活动的影响

结果表明，与空白对照组相比较，刺人参总皂苷中剂量与高剂量能降低小鼠自主活动次数和站立次数；刺人参总皂苷中剂量与高剂量小鼠活动次数显著多于阳性对照组，但在站立次数方面，与阳性组差异不具有统计学意义，见表1。

表1 刺人参总皂苷对小鼠自主活动的影响（±s,n=10）

表1 刺人参总皂苷对小鼠自主活动的影响（±s,n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组；#P＜0.05 vs 阳性对照组

组别 剂量/mg·kg-1 活动次数/次·(10 min)-1站立次数/次·(10 min)-1空白组 - 202.6±43.9 182.4±94.1刺人参总皂苷 150 189.7±43.4 180.7±34.1 300 142.8±62.8*# 112.7±60.9*600 131.3±32.2*# 122.3±43.6*地西泮 2.5 100.4±32.8** 94.7±30.1**

3.2 东北刺人参总皂苷对阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的影响

结果见表2。由表2可见，与空白对照组相比，刺人参总皂苷能显著延长小鼠睡眠时间，缩短睡眠潜伏期，但与空白对照组相比较差异无统计学意义。与阳性对照组比较，刺人参总皂苷对小鼠睡眠潜伏期与睡眠时间的影响差异均无统计学意义。

表2 刺人参总皂苷对阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的影响（±s,n=12）

表2 刺人参总皂苷对阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的影响（±s,n=12）

注：*P＜0.05 vs 空白对照组

组别 剂量/mg·kg-1 潜伏期/min 睡眠时间/min空白组 - 6.87±2.61 17.14±4.94刺人参总皂苷 150 6.06±1.13 22.47±6.93 300 5.92±1.15 32.07±9.26*600 5.62±1.28 32.26±11.34*地西泮 2.5 4.81±1.75* 36.65±10.58*

3.3 东北刺人参总皂苷对阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠发生率的影响

结果表明，与空白对照组相比较，刺人参总皂苷能提高小鼠睡眠发生率；与阳性对照组比较，刺人参总皂苷对小鼠睡眠发生率的影响差异无统计学意义，见表3。

表3 刺人参总皂苷对阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠发生率的影响（n=12）

3.4 东北刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠睡眠的影响

结果表明，给予PCPA可缩短戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠持续时间，与空白组相比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明模型复制成功。给予刺人参总皂苷后，与PCPA组比较，刺人参总皂苷可缩短戊巴比妥钠所致小鼠睡眠潜伏期，结果见表4。

表4 刺人参总皂苷联合PCPA对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响（±s,n=10）

表4 刺人参总皂苷联合PCPA对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的影响（±s,n=10）

注：*P＜0.05 vs 空白对照组；#P＜0.05 vs PCPA组

组别 剂量/mg·kg-1 潜伏期/min 睡眠时间/min空白组 - 3.62±0.59 86.2±22.9 PCPA组 350 4.04±0.76 58.7±16.31*刺人参+PCPA组 300/350 2.95±0.38*# 70.2±28.89

3.5 东北刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠脑内海马、皮质、下丘脑中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响

与空白组比较，PCPA组小鼠脑内IL-1β、TNF-α含量明显降低，IL-4及IL-10含量升高。给予刺人参总皂苷后，睡眠剥夺小鼠脑内IL-1β及TNF-α含量升高，IL-4及IL-10含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表5～7。

表5 刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠脑内海马中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响（±s,n=12）

表5 刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠脑内海马中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响（±s,n=12）

注：*P＜0.05 vs 空白对照组；#P＜0.05 vs PCPA组

组别 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白组 160.58±22.18 511.25±54.76 84.50±13.79# 320.33±36.77 PCPA组 146.92±23.18 480.50±64.76 100.40±20.01* 316.00±42.80给药组 147.83±12.58 485.50±80.85 89.65±12.63 314.00±41.36

表6 刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠脑内皮质中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响（±s,n=12）

表6 刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠脑内皮质中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响（±s,n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PCPA组

组别 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白组 171.08±17.08## 534.25±66.3# 106.65±14.31 307.00±29.94#PCPA组 134.33±26.25** 451.50±50.92* 94.95±16.33 346.83±39.40*给药组 138.92±8.73** 491.50±54.06 89.25±16.25* 325.83±31.32

表7 刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠脑内下丘脑中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响（±s,n=12）

表7 刺人参总皂苷对PCPA所致睡眠剥夺小鼠脑内下丘脑中IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10含量的影响（±s,n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PCPA组

组别 IL-1β含量/pg·ml-1 TNF-α含量/pg·ml-1 IL-4含量/pg·ml-1 IL-10含量/pg·ml-1空白组 158.42±11.00 522.75±42.46 88.85±13.02 346.33±34.41 PCPA组 155.42±15.60 510.25±49.81 102.00±13.63 349.83±26.67给药组 162.00±18.46 672.00±44.44**## 92.75±29.83 331.50±24.55

4 讨论

本实验首先从动物行为药理学研究入手，探讨了东北刺人参总皂苷对小鼠自主活动及阈上阈下戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间和睡眠发生率的影响。目前评价药物对中枢神经系统的影响，小鼠自主活动实验是比较简单、易行的药理学方法之一[8]。药物对中枢的兴奋或抑制作用通常能通过自发活动次数反映，兴奋时活动次数增加，抑制时活动次数减少，所以小鼠自主活动实验是评价中枢神经系统兴奋状态的一项重要指标[9]。本实验通过东北刺人参总皂苷对小鼠自主活动的影响可看出东北刺人参有效成分能显著减少小鼠自主活动，具有明确的镇静、抑制中枢的作用。

戊巴比妥钠协同实验是考察镇静催眠药物的常用方法[10]。受试药物若能延长阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间或缩短睡眠潜伏期或增加阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠发生率，则说明受试药物与戊巴比妥钠有协同作用，且单纯抑制肝药酶，减少戊巴比妥钠代谢的药物不会明显影响阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠发生率[11]。本实验中给予了东北刺人参总皂苷的实验动物对阈剂量戊巴比妥钠能明显缩短睡眠潜伏期和延长睡眠时间，对阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠发生率也有显著提高，且作用与阳性对照药物无明显差异，这些结果均显示东北刺人参总皂苷具有改善睡眠的作用，且此种作用与肝药酶无关。

一般认为，改善睡眠可降低对免疫相关疾病的易感性，提高免疫力也可改善睡眠状态[12]。因此，许多免疫增强剂及免疫调节剂都具有调节睡眠时相，改善睡眠质量的作用。同样的，由于睡眠期间免疫系统会维持其平衡功能，因此，睡眠也成为免疫系统的重要调节剂。另一方面，睡眠不足会影响新陈代谢，可能是慢性炎症和代谢性疾病发展的危险因素。促炎性细胞因子IL-1，IL-6和TNF会增加非快速眼动睡眠，而消炎性细胞因子（如IL-4和IL-10）会减少睡眠时间[13]。东北刺人参为五加科植物，以往实验报道证明了东北刺人参具有增强免疫的作用[14]。因此本实验重点考察了东北刺人参改善睡眠的细胞因子机制。

实验结果显示，给药组实验动物的脑内不同部位与睡眠相关的细胞因子均发生了不同程度的含量变化，总体显示为促进睡眠的细胞因子含量增高，抑制睡眠的细胞因子含量降低。说明细胞因子机制可能是刺人参总皂苷改善睡眠作用的机制之一。