血浆Ki67联合miRNA-26b检测诊断肝细胞癌价值分析*

王若宇，伍玉南，唐 丹

细胞核增殖抗原Ki67是反映细胞增殖的核抗原，是目前应用最广泛的增殖细胞标记之一。临床上，检测肿瘤组织Ki67可反映肿瘤细胞增殖水平，预测肿瘤患者预后[1,2]。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码RNA，在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥重要作用，在肿瘤组织和正常组织其水平存在差异[3]。研究表明，非小细胞肺癌患者癌组织miRNA-26b水平与癌旁组织或良性病变的正常组织相比均显著下调，以此诊断非小细胞肺癌的敏感性和特异性分别为79.9%和79.4%。miRNA-26b表达是非小细胞肺癌预后不良的危险因素[4]。本研究采用RT-qPCR法检测了HCC患者血浆Ki67和miRNA-26b水平，分析了不同临床和病理学特征患者这两种指标的差异，或为临床诊断HCC患者提供新手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年12月～2018年12月我院诊治的HCC患者90例，男57例，女33例；年龄28～71岁，平均年龄为(50.1±11.7)岁。诊断符合《原发性肝癌规范化诊断指南(2015年版)》[5]。另选择乙型肝炎肝硬化患者60例，男36例，女24例；年龄25～74岁，平均年龄为(48.2±12.0)岁，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》的标准[6]。排除标准：1)入院时肝功能存在严重障碍；2)合并其他恶性肿瘤；3)接受放化疗及其他辅助治疗。本研究通过了我院医学伦理委员会的批准，患者签署了知情同意书。

1.2 主要试剂 TRIzol Reagent、miRNA-26b、U6引物(均购自美国Invitrogen公司)，Ki67和β-actin上下游引物(北京六合华大基因科技股份有限公司)，SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)，无核酸酶水(DEPC处理水，Sigma)。

1.3 血浆miRNA-26b和Ki67水平检测 抽取外周静脉血6 mL，置于EDTA抗凝管，1 h内在4℃条件下用低速离心机2500 r/m离心10 min。取血浆600μL，分装于2 mL无RNA酶的EP管中，置于-80℃冻存。在血浆中加入TRIZOL 1 mL，混匀后冰上静置5 min；加入氯仿200 μL，充分震荡，冰上静置5 min，4℃，12000 r/m离心15 min。轻取上层液体，加入异丙醇500 μL，冰上静置10 min，12000 r/m离心10 min，弃去上清液，留RNA沉淀，加入75%乙醇1 mL，充分混匀，7500 r/m离心5 min，弃去上清液，干燥5 min，加入DEPC 15 μL，溶解RNA。在260 nm和280 nm处检测吸光度值。当吸光度值>1.8且<2.0时，用于检测。实时定量qPCR检测：将提取得到的RNA用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。检测miRNA-26b时以U6作为内参，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR法检测。引物设计如下：Ki67上游：5'-ACGAGACGCCTGGTTACTATCA-3'，下游5'-CTGTTTTGCTGCATTCTGTGC-3'；β-actin上游：5'-TCGTGCGTGACATTAAGG-3'，下游5'-AGGAAGGA-AGGCTGGAAG-3’；miRNA-26b上游：5'-GAAGATCTATGGCCCATCTGAGGTTG-3'，下游5'-CCCAAGCTTAAAAACCTGGA-CCACGAAT-3'；U6上游：5'-CTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游5'-AAAATATGCAACGCTTCACG-3’。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。扩增完毕后，进行熔解曲线分析，每个样本重复检测3次。Ki67和miRNA-26b RNA相对水平按公式(2-△△Ct法)计算。根据ROC曲线结果，确定Ki67和miRNA-26b mRNA水平的临界值。ROC曲线上两个指标串联试验是依次进行几项检验项目，先做特异性高的实验A，A为阳性者再做B。只有试验结果为阳性时才判断为阳性，否则为阴性；并联试验是同时做几种检验项目，其中一项为阳性即判断为阳性。检测水平高于临界值时，为高水平，反之则为低水平。

1.4 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料采用卡方检验，计量资料呈非正态分布，故以【M(Q1,Q3)】表示，组间两两比较采用Mann-Whitney U 检验；绘制ROC曲线，分析血浆Ki67和miRNA-26b诊断HCC的价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆Ki67和miRNA-26b水平比较 HCC患者血浆Ki67水平为【1.6(1.1～2.2)】，显著高于肝硬化组【0.4(0.1～1.2)，P<0.05】；HCC患者血浆miRNA-26b水平为【0.7(0.3～1.4)】，显著低于肝硬化组【2.0(1.4～3.0)，P<0.05】。

2.2 不同临床和病理学特征患者血浆Ki67水平分布比较 将不同肿瘤直径、Edmonson分级、早期复发和肿瘤转移患者进行单因素分析，结果发现不同肿瘤Edmonson分级、早期是否复发和肿瘤转移患者血浆Ki67水平差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.3 不同临床和病理学特征患者血浆 miRNA-26b水平分布比较 不同Edmonson分级、早期是否肿瘤复发和转移患者血浆miRNA-26b水平存在显著性差异(P<0.05，表2)。

2.4 血浆Ki67和miRNA-26b水平诊断HCC的效能分析 血浆Ki67诊断HCC的ROC曲线下面积为0.8(95%置信区间为0.7～0.9)。血浆miRNA-26b诊断HCC的ROC曲线下面积为0.8(95%置信区间为0.8～0.9)。两指标联合检测串联试验可提高诊断HCC的特异度，并联试验可提高诊断的灵敏性(表3)。

表1 不同临床和病理学特征患者血浆Ki67水平分布(%)比较

表2 不同临床和病理学特征患者血浆 miRNA-26b水平分布(%)比较

表3 血浆Ki67和miRNA-26b诊断HCC的效能

3 讨论

HCC 位居世界第五大常见肿瘤。由于HCC 发病隐匿，病情进展迅速，当患者确诊时大多已经处于疾病的中、晚期，错过了手术时机，即使行肿瘤切除术后也很容易复发[7]。HCC筛查和早期诊断临床意义重大。然而，目前处于研究阶段的大量 HCC标志物，诊断的准确性并不优于影像学方法或血清AFP，且绝大多数未进入临床应用[8-11]。因此，寻找有效的诊断HCC生物标志物是目前临床诊断和治疗HCC患者亟待解决的关键性问题。

肿瘤学研究的一个重要问题是预测肿瘤的进展和患者的生存率。传统上，肿瘤的类型、分期和细胞有丝分裂活性是主要的预后标准[10]。Ki67是一种非组蛋白核皮质蛋白，参与聚合酶I依赖性核糖体RNA合成的早期步骤。Ki67水平在整个细胞周期内都在变化，在有丝分裂期间达到峰值水平。虽然Ki67的功能尚未完全阐明，但有证据表明它在细胞分裂和核糖体RNA合成中起作用[12-14]。因此，Ki67的重要性越来越大，特别是在生长缓慢的肿瘤，如胃肠道胰腺神经内分泌肿瘤(GEP-NENS)[15-17]。本研究结果发现，HCC患者血浆Ki67水平升高，而且在不同Edmonson分级、是否存在早期肿瘤复发和肿瘤转移的HCC患者血浆Ki67水平显著不同。ROC曲线分析结果表明，血浆Ki67水平诊断HCC的ROC曲线下面积为0.8，其相应的诊断灵敏性和特异度分别为55.6%和95.0%，提示血浆Ki67水平是可以作为诊断HCC的一个新指标。

近年来，miRNA的发现和深入研究为肿瘤靶向研究提供了新的思路，成为目前肿瘤靶向治疗研究的最新热点。采集患者外周血并检测miRNAs，方法简单、方便，更容易被患者和临床医生所接受，且miRNA 具有非常强的稳定性，常温放置超过 24 h、反复冻融、强酸强碱等极端条件都不影响其稳定性[18-20]。研究表明，miRNA作为癌基因或肿瘤抑制因子而发挥作用。作为肿瘤相关小RNA之一的miRNA-26b可能在功能上能调节癌细胞的生长，如在人食管癌、鼻咽癌、原发性鳞状细胞肺癌和舌鳞状细胞癌等。此外，一些研究报告发现，在一些癌症，如乳腺癌和胃癌，miRNA-26b水平下调，表明miRNA-26b是一种肿瘤抑制因子。miRNA-26b的过度表达可显著抑制体外肺癌细胞或结肠癌细胞等肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭，抑制肿瘤的生长[19，20]。有研究发现，过表达miR-26a可通过HGF-cMet信号抑制HCC组织血管生成，从而抑制 HCC的生长和肝内转移，是肝癌新的治疗靶点和预后指标。本研究结果发现，HCC患者血浆miRNA-26b显著低于乙型肝炎肝硬化患者。不同肿瘤Edmonson分级、是否存在早期肿瘤复发或肿瘤转移的HCC患者血浆miRNA-26b水平显著不同。ROC曲线分析结果表明，血浆miRNA-26b水平诊断HCC的ROC曲线下面积为0.8，其相应的诊断灵敏性和特异度分别为70.0%和83.3%。血浆Ki67和miRNA-26b联合诊断的效能与血浆Ki67或miRNA-26b单独指标比，诊断效能显著提高，可为HCC的诊断提供重要的参考信息。