猪MAP2K6 基因多态性及其与经济性状的关联分析

张佳丽，聂光伟，刘 军，左 波

（农业部猪遗传育种重点实验室，华中农业大学动物科技学院，湖北武汉 430070）

分子标记辅助选择（Marker Assistant Selection，MAS）是指在基因克隆或定位的基础上，通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记，在群体中对含有目标性状的个体进行选择[1-2]。对含有目标性状的个体进行快速、准确的选择，而且不受外界环境的影响，这在一定程度上解决了育种过程中存在的盲目性、效率低的问题，大大加快了育种进程[3]，促进了分子标记辅助选择和基因组选择在猪生产上的应用。猪MAP2K6基因位于12 号染色体，编码丝裂原活化蛋白激酶激酶6（Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 6，MAP2K6）。MAP2K6基因属于MAPK家族的一员，目前已鉴定出4 种MAPK家族成员，分别是细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular Signal-regulated Kinase 1/2，ERK1/2）、ERK（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogenactivated Protein Kinase，p38MAPK）和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）[4]，分别介导4 条并行的MAPK信号通路。其家族成员主要参与调控多种细胞的关键信号级联反应，能被生长因子、促细胞分裂素、细胞因子及各种形式的环境应激因素所激活，而MAP2K6基因的激活是由于对丝氨酸和苏氨酸残基进行双重磷酸化引起的[5]。p38是MAPK超家族的另一成员，MAP2K6基因是其上游的一个特异激活因子[6]，二者之间具有一定的相互作用，Fujishiro 等[7]研究表明，MAP2K6和p38MAPK信号通路的激活，能调节葡萄糖转运蛋白的表达且对胰岛素信号通路具有抑制作用。根据Meng 等[8]的报道，MAP2K6及PLCB1基因共同参与促性腺激素信号通路的传导，对动物个体的生长发育具有重要作用。

在实际生产中，对QTLs 的定位并进行分子标记是一种行之有效的重要育种手段。如Tang 等[9]通过鉴定CNN3基因的SNP 位点初步确定了该基因与仔猪断奶重、出生重等生长性状有关。MAP2K6基因通过调节PPARγ及CEBPβ基因的表达，进而激活p38MAPK，促进脂肪的形成[10]，证明MAP2K6基因与牛胴体性状具有遗传关联。Meng 等[8]在大白猪群体中通过GWAS方法鉴定与其生长性状相关的候选基因，结果表明在10 905 724 bp 位置处存在1 个候选基因MAP2K6，与猪的平均日增重显著相关。因此，在本研究中将MAP2K6作为猪经济性状的候选基因。基于MAP2K6基因的生物学功能和QTL 定位结果，本实验鉴定了法系大白猪群体中SNPs 位点并分析了猪的重要经济性状，期望能够发现可用于育种实践的DNA 分子标记，为猪分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验猪群及性状记录 采集384 头法系大白猪前腔静脉血液，使用血液基因组DNA 中量提取试剂盒（离心柱型）提取样品DNA，并于-80℃超低温冰箱中保存。测定的表型性状及数据收集包括达100 kg 体重日龄（d）、背膘厚（mm）、初生重（kg）、体长（cm）、眼肌面积（cm2）、左乳头数和右乳头数。本研究用B 型超声设备测定猪背膘厚和眼肌面积（背膘厚及眼肌面积测定位置在猪倒数第3、4 根肋骨距离背中线4～5 cm 处），测量数据由育种软件GBS5.0 校正后得到。

1.2 法系大白猪4 个SNPs 的鉴定与分析 在NCBI 数据库中查找目的基因DNA 序列（XM_021068116.1），使用Premier 5.0 软件设计引物，并由上海生工生物工程技术有限公司合成。扩增各基因所用引物及目的片段长度如表1 所示。PCR 扩增反应总体系为20.0 μL：DNA模板1 μL，2×Taq PCR Mix 10.0 μL，ddH2O 8.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL。PCR 反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，退火30 s，72℃延伸，共36 个循环；最后72℃延伸5 min。PCR 产物于琼脂糖凝胶电泳检测，以5 μL 的DNA Marker DL2000作为参照。电泳结束后利用凝胶成像系统观察扩增结果。

1.3 SNP 质谱分型 本实验室委托北京康普森生物技术有限公司对MAP2K6基因的4 个突变位点rs345304630（SNP1）、rs325278117（SNP2）、rs332017877（SNP3）和325752048（SNP4）采用质谱分型，检测法系大白猪DNA 样本。实验的主要流程：DNA 提取、质检；DNA 浓度调试；引物设计、溶解、稀释；PCR 扩增；PCR 产物碱性磷酸酶处理；单碱基延伸；树脂纯化；芯片点样；质谱检测；统计基因型。

表1 MAP2K6 引物序列

1.4 数据分析 采用SAS 统计软件中的混合线性模型（Mixed），以GLM 程序进行基因型和性状表型值之间的关联分析及显著性检验，结果以平均值±标准误表示（不同基因型表型数值间P＜0.01 判定为差异极显著，P＜0.05 判定为差异显著；若P＞0.05 则不显著）。应用Excel 软件分别计算基因型频率和等位基因频率，并进行χ2检验，分析其是否符合哈代-温伯格平衡（P＞0.05表示处于遗传平衡状态，P＜0.05 则相反）。生长性状分析模型：

式中，Yijkl为性状观察值；u为性状总平均值；Gi为基因型效应（包括基因加性效应和显性效应）；Mj为年-季度效应；Xk为性别效应及固定效应；Sl为父本效应及随机效应；e为随机误差，假定服从（0，χ2）分布。

2 结果

2.1MAP2K6基因多态性检测 测序结果表明，在法系大白猪MAP2K6基因内含子8、内含子11 和外显子12区域共鉴定出4 个SNPs，包括SNP1（rs 345304630）、SNP2（rs 325278117）、SNP3（rs 332017877）和SNP4（rs 325752048）。如表2 所示，采用飞行时间质谱的方法对MAP2K6基因4 个SNPs 位点进行基因型分析，均检测到3 种基因型。

对MAP2K6基因多态性位点不同基因型与法系大白猪的经济性状进行相关性分析（表3），结果发现，法系大白猪的SNP1 与达100 kg 体重日龄和右乳头数性状存在显著相关性，AA 基因型个体达100 kg 体重日龄显著低于AG 基因型个体，说明AA 基因型个体具有较快的生长速度；GG 基因型个体右乳头数显著高于AG 基因型个体；SNP2 与达100 kg 体重日龄和右乳头数性状存在显著相关性。AA 基因型个体达100 kg 体重日龄显著低于AG 基因型个体，GG 基因型个体具有较快的生长速度，AA 基因型个体右乳头数显著高于AG基因型个体；SNP3 与达100 kg 体重日龄和右乳头数性状存在显著相关性，AA 基因型个体达100 kg 体重日龄显著低于AG 基因型个体，说明AA 基因型个体具有较快的生长速度，GG 基因型个体的右乳头数显著高于AG 基因型个体；SNP4 与眼肌面积存在显著的相关性，AG 基因型个体眼肌面积显著低于AA 基因型个体。

表2 MAP2K6 基因SNPs 基因频率和等位基因频率

表3 MAP2K6 基因多态性与法系大白猪经济性状的关联分析

2.2 法系大白猪MAP2K6基因3 个SNPs 连锁不平衡及单倍型分析 如图1 所示，SNP1（rs345304630）和SNP2（rs325278117）、SNP1（rs345304630）和SNP3（rs332017877）在法系大白猪中处于完全LD（D'=1和r2=1），SNP2（rs325278117）和SNP3（rs332017877）处于强LD（D'=1 和r2=0.99）。如表4 所示，MAP2K6基因3 个SNPs 在法系大白猪中形成1 个单倍型模块，共产生2 种单倍型，单倍型H2（AGA）的频率均低于单倍型H1（GAG)。

图1 法系大白猪MAP2K6 基因SNPs 连锁不平衡区

2.3 法系大白猪MAP2K6基因单倍型组合与生长育肥和乳头数性状关联分析 由表5 可知，MAP2K6基因在法系大白猪群体中共产生3 种单倍型组合，单倍型组合H1-H1、H1-H2、H2-H2 与体长、乳头数、达100 kg 体重日龄、背膘厚、初生重和眼肌面积性状有显著关联性。

表4 法系大白猪MAP2K6 基因单倍型频率

2.4MAP2K6在猪各组织中差异表达分析 由图2 可知，MAP2K6基因在法系大白猪13 个组织中表达量不同，其中在脾和脂肪中表达量最高，在肝、心、腿肌、肾、舌中的表达量没有显著性差异。

3 讨 论

已有研究表明，在杜洛克猪中鉴定出MAP2K6与猪的繁殖性状有关[11]，但并没有做进一步研究。本研究首次在法系大白猪MAP2K6基因上发现4 个SNP 位点，与达100 kg 体重日龄、右乳头数和眼肌面积有显著相关；MAP2K6基因在猪各组织中的表达谱结果说明，MAP2K6在脂肪中高表达。MAP2K6在脂肪细胞和葡萄糖转运蛋白表达中起重要作用[5,7,12]，该基因调控机体能量转化，参与GnRH 信号通路[12]，GnRH 信号传导在哺乳动物青春期开始时的生长中也起着重要作用[13-18]。在其他动物中，Ryu 等[19]研究表明MAP2K6基因与牛的胴体性状（胴体重、背膘厚和大理石纹评分）具有相关性，且在该基因第1 和第11 内含子上鉴定到4 个单核苷酸多态性位点，其中c.17-10118T＞G 多态性位点显著影响牛的胴体重和大理石纹评分。猪MAP2K6可能是通过影响其胴体性状、繁殖性状和生长性状从而影响脂肪的形成，这还需要进一步研究。另外，本研究出现这种结果可能是由于生存环境、遗传背景、种质特征等因素的不同，导致该基因的转录因子调控差异，进而影响MAP2K6的mRNA 表达水平。MAP2K6基因可能通过调控动物个体的能量利用水平、激素水平等影响其生长发育。因此该基因可作为研究猪生长性状的一个候选基因。目前，仅有一篇报道表明MAP2K6基因与猪的平均日增重具有相关性[8]。因此，对猪MAP2K6基因功能和SNP 的关联仍然需要进一步研究。

图2 MAP2K6 基因在法系大白猪不同组织中表达差异

在本研究中，多态性位点rs345304630、rs325278117和rs332017877 均处于遗传平衡状态，并未受到遗传漂变等外界因素的影响，这些多态性位点在群体中可以稳定遗传。猪生长育肥和乳头数性状是受到多基因调控的复杂性状，单个SNP 不足以阐明基因与性状间的因果关系[20]。在本研究中，法系大白猪MAP2K6基因3 个SNPs（rs345304630、rs325278117 和rs332017877）处于强连锁不平衡，且3 个SNPs 形成一个紧密连锁的整体。单倍型组合与猪生产育肥和乳头数性状并无显著关联性，推测可能由于实验样本量较少导致，下一步将扩大样本量检测MAP2K6基因在不同品种猪群的多态性，为分子标记辅助选择和全基因组选择提供理论依据和标记资源。

4 结 论

本研究中，MAP2K6基因多态性位点SNP1（rs345304630）、SNP2（rs325278117）和SNP3（rs332017877）与法系大白猪达100 kg 体重日龄和右乳头数显著相关，SNP4与眼肌面积显著相关，其中SNP1（rs345304630）和SNP3（rs332017877）多态性位点的AA 基因型个体生长速度明显高于AG 和GG 基因型个体，在实际生产中，可以选择AA 基因型个体的母猪来缩短达100 kg 体重日龄，提高经济效率；SNP1（rs345304630）、SNP2（rs325278117）和SNP3（rs332017877）多态性位点的GG 基因型个体乳头数显著高于AA 和AG 基因型个体，通过选择GG 基因型个体来增加母猪的泌乳和带仔能力，对提高哺乳仔猪的存活率和断奶重具有重大意义。

表5 法系大白猪MAP2K6 基因二倍型与生长发育及乳头数性状的相关性分析