肝星状细胞在慢加急性肝衰竭小鼠模型发病进程中的作用及机制

田 臻， 王丽莎， 姚耐娟， 赵英仁， 阮骊韬

西安交通大学第一附属医院 a.感染科， b.超声影像科， c.妇产科， 西安 710061

肝衰竭是病毒性、酒精性、药物性以及缺血再灌注等多种因素引起的严重肝损伤。随着人工肝、肝移植等治疗手段的普及，肝衰竭患者的病死率显著降低，但仍不低于40%[1]。在我国，继发于慢性肝病的慢加急性肝衰竭(ACLF)约占肝衰竭患者总数的80%，肝衰竭特别是ACLF是威胁国人健康的重要疾病负担[2]。

肝衰竭是由炎症介导的肝细胞损伤过程，过度的炎症反应是肝衰竭发病过程的中心环节，抑制肝脏炎症反应能够阻止肝衰竭的进程[3]。在肝衰竭的发病过程中，由于肠道通透性的增加，患者经常表现为内毒素血症，即血液中内毒素(LPS)水平升高[4]。肝星状细胞(HSC)占肝内细胞总数的5%～8%，是肝脏中肝细胞以外数量最多的细胞。研究[5-6]表明在肝癌和自身免疫性肝病的发病过程中，HSC可分泌炎症因子促进疾病的进展。关于HSC在肝衰竭过程中的作用目前只有少数几篇报道，HSC在肝衰竭疾病进程中的作用目前尚不完全清楚。作者的研究结果发现HSC在肝衰竭的发病过程中扮演着重要的角色：(1)在肝衰竭过程中HSC活化并分泌细胞外基质维持肝脏结构，避免肝脏塌陷从而发挥保护作用，肝衰竭过程中多种细胞因子抑制HSC活化促进肝衰竭[7]；(2)LPS通过激活NLRP3炎症小体诱发HSC炎症反应参与肝衰竭的发病过程[8]。然而，HSC炎症参与肝衰竭疾病进程的具体机制目前尚不完全清楚。

研究[9]认为炎症和氧化应激共同参与肝衰竭，肝内炎症反应可直接诱发肝细胞损伤，损伤的肝细胞增强肝内氧化应激水平，促进肝细胞的死亡并抑制肝细胞再生，形成恶性循环。活性氧(ROS)参与多种炎症细胞的炎症反应过程，损伤线粒体产生ROS激活NLRP3炎症小体，引发炎症反应，这一机制可能也参与了肝衰竭的发病过程。最近的研究显示，Reg3α凝集素抑制ROS进而减轻LPS+D-GalN所诱发的小鼠急性肝衰竭的过程[10]。本实验旨在从氧化应激的角度探究HSC炎症反应在ACLF发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性昆明种小鼠45只，6周龄，体质量(20±2) g，清洁级，购于西安交通大学医学院实验动物中心，实验动物生产许可证编号：SCXK(陕)2018-001，实验动物使用许可证编号：SYXK(陕)2018-001。人血白蛋白购于瑞士杰特贝林生物制品有限公司，LPS、D-GalN及N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)购于美国Sigma公司，Annexin V-PI凋亡试剂盒购自美国BD公司，兔抗小鼠Caspase 3、Caspase 8及β-Actin单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，IL-1β及IL-6 ELISA检测试剂盒购于美国R&D SYSTERM公司，相关生化指标检验试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 动物分组及模型制备 将小鼠随机分为对照组、模型组和NAC组，每组15只。模型组和NAC组小鼠人血白蛋白致敏后，尾静脉注射人血白蛋白15 μg/g，每周2次，共12周；之后皮下注射人血白蛋白15 μg/g，每周1次，共4周，构建小鼠慢性肝病模型；最后腹腔注射10 ng/g的LPS和800 μg/g的D-GalN诱导小鼠ACLF。NAC组小鼠ACLF造模前1周起每日按60 μg/g腹腔注射NAC，连续7 d，观察小鼠一般状况和病死率。小鼠死亡后立即摘除眼球取血，同时切取新鲜肝脏组织用4%中性甲醛固定，未死亡模型组和实验组小鼠LPS+D-GalN造模后48 h时处死；对照组注射等量生理盐水，与另两组小鼠同一时间处死，收取小鼠血液及肝组织备用。

1.3 生化指标检测 转氨酶(AST、ALT)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于南京建成生物工程研究所，按说明书方法测定小鼠血清AST、ALT，肝组织MDA、SOD含量。

1.4 肝组织病理学 肝组织置于4%多聚甲醛固定液中固定12 h，经脱水、透明、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、常规HE染色和光学树脂封片，显微镜下观察肝组织损伤情况。肝衰竭的病理表现为大片或亚大片肝细胞坏死，间质组织塌陷，并伴有炎症细胞浸润。在本研究中，通过半定量病理指数评定肝脏组织病理改变：每个样本测定10个视野，计数每个视野中病变肝细胞数所占百分比，并换算成小数。

1.5 细胞培养 人肝星状细胞系LX2细胞和人肝细胞系HL7702细胞接种于含10%胎牛血清及抗生素的DMEM培养基中，置于37 ℃、50 ml/L CO2、95%湿度的孵育箱中传代培养，取生长状态良好的指数生长期细胞进行实验，在添加(不添加)10 mmol/L NAC的情况下用1 μg/ml LPS、400 μmol/L H2O2刺激LX2细胞4 h，ELISA法检测培养基中IL-1β及IL-6。用1 μg/ml LPS、400 μmol/L H2O2刺激LX2细胞4 h，PBS洗涤LX2细胞3次后更换培养基培养24 h，收取LX2培养基培养HL7702细胞12 h，Western Blot检测HL7702细胞Caspase 8和Caspase 3表达，流式细胞法检测细胞凋亡。

1.6 Western Blot检测蛋白表达 用蛋白质抽提剂按步骤提取HL7702细胞中总蛋白，Western Blot按常规步骤进行，行SDS凝胶电泳，半干法转膜50 min转PVDF膜，加入兔抗小鼠Caspase 3和Caspase 8单克隆抗体4 ℃孵育过夜后应用羊抗兔IgG第二抗体孵育1.5 h，ECL发光液孵育1 min后压X光片，显影、压片。

1.7 流式细胞仪检测HL7702细胞凋亡 各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化, 制成单细胞悬液, PBS漂洗, 重悬在1×结合缓冲液中, 调细胞密度为106个/ml, 用5 μl Annexin V-FITC和1×结合缓冲液室温孵育15 min, 然后加入400 μl 1×结合缓冲液和5 μl PI工作液, 置于冰上, 尽快对染色细胞于流式细胞仪检测分析。

1.8 伦理学审查 本研究方案经由西安交通大学第一附属医院实验动物伦理委员会审批，批号：2018伦审科字第G-125号，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 小鼠一般状况 对照组15只小鼠全部存活；模型组15只小鼠D-GalN+LPS造模4 h后出现活动明显减少、竖毛、萎靡、拒食等现象，6 h后症状加剧并开始出现昏迷、抽搐甚至死亡，至48 h时模型组共有小鼠12只死亡，存活率达20%(3/15)；NAC组小鼠ACLF表现较模型组轻，48 h时累积生存率为53.3%(8/15)。根据各组小鼠的存活情况绘制生存曲线，采用Kaplan-Meier法分析显示，NAC治疗组小鼠48 h累积生存率明显优于模型组(χ2=23.06，P<0.001)(图1)。

图1 各组小鼠的生存曲线

2.2 小鼠肝脏生化学指标检测 与对照组及NAC组相比，模型组小鼠血清AST、ALT水平及肝组织MDA含量显著升高，肝组织SOD水平显著降低(P值均<0.01)(表1)。各组间血清LPS水平比较差异有统计学意义(F=42.200，P<0.01)，模型组及NAC组小鼠血清LPS水平较对照组均显著升高(P值均<0.05)。各组间血清IL-1β水平比较差异有统计学意义(F=35.820，P<0.01)，与对照组相比，模型组小鼠血清IL-1β水平显著升高(P<0.05)，NAC组血清IL-1β水平较模型组显著降低(P<0.05)(图2)。

图2 各组小鼠血清LPS和IL-1β水平比较

表1 各组小鼠血清ALT、AST及肝组织MDA和SOD水平

2.3 小鼠肝组织病理改变 对照组小鼠:肝组织颜色鲜红，质地柔软，被膜光滑、完整，镜下肝小叶结构清晰，肝细胞沿中央静脉放射排列；模型组小鼠:肝脏肿胀明显，表面可见弥漫性出血点及散在瘀斑，质地偏韧，光镜下可见肝小叶结构破坏，肝细胞变性坏死，同时可见坏死区大量炎细胞浸润并细胞间出血、淤血；NAC组小鼠：肝脏表面瘀斑及出血点分布较模型组轻，镜下肝小叶破坏、肝细胞坏死及炎细胞浸润等状况较模型组明显减轻(图3)。小鼠肝脏病理评分3组间比较差异有统计学意义(F=32.250，P<0.01)，模型组小鼠肝脏病理评分明显高于对照组和NAC组(P值均<0.05)(图4)。

注:a,对照组；b,模型组;

图4 各组小鼠肝脏病理评分

2.4 LPS诱导HSC炎症反应 LPS及H2O2均可刺激LX2细胞分泌炎症因子IL-1β和IL-6，特别发现应用抗氧化剂NAC可有效抑制LPS或H2O2介导HSC炎症反应、减少炎症因子IL-1β和IL-6的分泌。对照组LX2细胞经PBS作用后分泌极低水平的炎症因子IL-1β和IL-6。各组间培养基IL-1β水平比较差异有统计学意义(F=37.740，P<0.01)，IL-6水平比较差异亦有统计学意义(F=58.800，P<0.01)(图5)。

2.5 共培养条件下HSC诱导肝细胞凋亡 经PBS作用的对照组LX2细胞与正常组相比，其诱导HL7702细胞表达凋亡相关蛋白Caspase 8、Caspase 3及细胞凋亡、坏死水平均未见明显并异。在LX2-HL7702的共培养体系中，经LPS或H2O2刺激的LX2细胞可使HL7702细胞表达的凋亡相关蛋白Caspase 8和Caspase 3明显增加，各组间相对表达水平比较差异均有统计学意义(F值分别为5.696、52.410、66.771，P值均<0.05)(图6a、b)；同时通过Annexin V-PI染色用流式的方法进行了检测，结果发现经LPS或H2O2刺激的LX2细胞可明显促进HL7702细胞的凋亡和坏死，各组间坏死、凋亡水平比较差异均有统计学意义(F值分别为217.006、127.600，P值均<0.01)(图6c、d)。

图5 NAC抑制LPS诱导的LX2炎症

3 讨论

本次研究通过尾静脉+皮下注射人血白蛋白的方法构建小鼠慢性肝病模型，并在此基础上通过腹腔注射LPS+D-GalN构建小鼠ACLF模型。实验结果显示，模型组小鼠病死率达80%，肝组织HE染色可见大片肝细胞坏死，间质组织塌陷，并伴有炎症细胞浸润。相较于对照组，模型组小鼠血清AST和ALT明显升高，肝组织MDA明显升高，SOD明显降低，表明成功建立小鼠ACLF模型。SOD是一种重要的抗氧化酶，是清除体内氧自由基的首要物质[11]，ACLF发病过程中小鼠肝脏SOD水平降低，从而导致肝脏氧化应激水平升高，参与ACLF的疾病进程。

抗氧化剂NAC有效降低模型小鼠病死率，逆转小鼠血清、肝组织生化指标的变化。ROS激活NLRP3炎症小体，促进炎症因子IL-1β、IL-6释放，炎症因子参与多种疾病的发病过程[12]。本研究中模型组和NAC组小鼠血清LPS水平均较对照组升高，而NAC组小鼠血清IL-1β水平较模型组明显降低。后续细胞学实验中也发现了这一现象，即抗氧化剂NAC有效抑制LPS或H2O2诱导HSC炎症反应，降低炎症因子IL-1β和IL-6分泌。

注：a～b, Western Blot检测HL7702细胞凋亡蛋白Caspase3和Caspase8的表达；c～d, Annexin V-PI染色后流式细胞术检测HL7702细胞的凋亡和坏死。

肝脏炎症反应与病毒性、酒精性、脂肪性和自身免疫肝病等多种慢性肝脏疾病的发病过程密切相关。炎症参与肝硬化、肝癌和肝衰竭等肝脏疾病的不同阶段。肝衰竭是炎症介导的肝细胞损伤、死亡过程，抑制肝脏炎症反应能够阻止肝衰竭疾病进程[13]。HSC是肝内重要的非实质细胞，本研究和之前的研究都表明炎症介质能够直接激活HSC的NLRP3炎症小体，促进HSC炎症反应。有研究[5]表明HSC炎症在自身免疫性肝病发病过程中发挥重要作用，HSC接收肝血窦内产生的炎症信号，通过自身炎症反应将其传递到肝实质诱导肝细胞损伤。

HSC与窦周血管内皮细胞(Sinusoidal endothelial cells, SEC)、Kupffer细胞(KC)共同构成肝血窦。生理条件下HSC的炎症功能相对较弱，肝脏炎症主要由KC和SEC等细胞引发[14-15]，LPS通过Toll样受体4激活KC、SEC分泌炎症因子，诱发肝脏炎症反应。肝衰竭时肝脏细胞大量死亡同时HSC活化增殖，HSC占肝内固有细胞比例由正常条件下的15%上升至50%[16]，提示HSC在肝衰竭发病过程中扮演重要角色。那么HSC炎症是否参与、如何参与肝衰竭的基本进程？针对这一问题，本研究在LX2细胞和HL7702细胞的共培养体系中探究了LPS对HSC炎症以及HSC炎症对肝细胞的影响，结果发现经LPS或H2O2刺激LX2细胞分泌炎症因子促进HL7702细胞凋亡。

综上所述，在肝衰竭的发病过程中，LPS可通过ROS促进HSC炎症，HSC分泌相关炎症因子进而诱导肝细胞凋亡，参与肝衰竭的疾病进程。调控炎症或氧化应激可能成为肝衰竭新的治疗靶点。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献说明：田臻负责课题设计、拟定写作思路；王丽莎、姚耐娟负责实验操作、论文撰写；田臻、王丽莎负责数据分析；田臻、赵英仁、阮骊涛负责论文审定。