蒙药额力根II号对肝纤维化大鼠的保护作用研究*

苏琪皓，任丽梅，姜凤霞，武金宝，江振宇

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝损伤的愈合反应，是由各种急慢性损伤引起肝细胞变性、坏死或凋亡，进而激活多种炎症相关因子的释放，启动各种炎症信号传导通路，导致肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化的结果[1,2]。在HSCs被激活过程中伴随着α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)高表达，同时分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分，以I型胶原蛋白(type I collagen)和III型胶原蛋白(type III collagen)为主[3,4]。长期临床实践证明中蒙药具有多靶点、多环节、多层次作用的优点，在防治HF中取得了较好的疗效[5-7]，在实验中也发现黄芪甲苷具有抗纤维化作用[8]。内蒙古自治区蒙药额力根II号是重组方剂，经过中蒙医人员长期临床观察，发现其具有清肝热、解毒、调理三根、养胃和肝之功效。本实验通过建立稳定的CCl4大鼠HF模型，给予不同剂量的额力根II号水煎液灌胃，探讨了其干预HF的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂与仪器 58只SPF级雄性SD大鼠，体质量为170±10 g，购自北京大学医学部实验动物科学部【许可证号为SCXK(京)2010-0002】。额力根II号【由金石榴10 g，柯子、栀子、川楝子、西红花、扁蕾、紫檀香、丁香、党参、丹参、黄芪、木香、柴胡、五味子、五灵脂(制)、草果仁、寒水石各5 g，冬虫夏草1 g，人工牛黄2 g组成，经包头市蒙中医院姜凤霞主任医师鉴定，由包头医学院第二附属医院中药房提供】。将额力根II号1付溶于纯净水200 ml，90℃水浴锅煮沸1 h，经沙布过滤，得到过滤液；重复上述步骤2次，最后将所有的过滤液放入旋转蒸发仪浓缩至50 ml，于4℃冰箱保存。CCl4购于枣庄水岚泰化工有限公司，抗α-SMA购于Leica公司，抗Collagen I购于Abcam公司，抗Collagen III购于Cellsignal公司，二抗等为Leica novocastra NovoLink聚合物检测系统RE7280-K检测试剂盒，苏木素购于福州迈新公司，Masson为广州维格斯特染试剂盒，血清肝功能试剂盒为宁波美康试剂盒，检测血清肝纤维化指标试剂盒购于北京北方生物技术有限公司，全自动生化分析仪为东芝TB120全自动生化分析仪，放射免疫分析仪为SN-697全自动双探头放射免疫γ计数器。

1.2 模型的制备 将SD大鼠适应性饲养1 w，随机分为对照组10只和模型组、小剂量组、中剂量组和大剂量额力根II号处理组(各12只)。将CCl4和橄榄油混合，配制成40% CCl4橄榄油溶液。在对照组，给予生理盐水3 ml.kg-1皮下注射，在其余各组，给予40% CCl4橄榄油溶液3 ml.kg-1腹部皮下注射，首剂加倍，2次/w，持续8 w[9]；自造模第4 w开始，各给药组分别给予额力根II号水煎液2.0 g.kg-1、4.0 g.kg-1和8.0 g.kg-1灌胃，对照组和模型组给予等剂量生理盐水灌胃，1次/d，持续给药5 w。在实验结束时，模型组、中剂量组和大剂量组各有3只大鼠死亡，小剂量组有2只大鼠死亡。在末次给药后禁食不禁水，24 h后给予10% 水合氯醛3 ml.kg-1腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血，分离血清；从距离肝门部2.0 cm处切取肝组织，置于4% 多聚甲醛溶液中固定，切片，行HE和Masson染色，参考Ishak评分系统[10]行HF评分。采用免疫组织化学染色法检测肝组织α-SMA、Collagen I和Collagen III表达。

2 结果

2.1 各组血生化指标比较 见表1。

表1 各组大鼠血生化指标比较

2.2 各组血清肝纤维化指标比较 见表2。

表2 各组大鼠血清肝纤维化指标(比较

表2 各组大鼠血清肝纤维化指标(比较

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05

只数HA(μg/L)CⅣ(μg/L)LN(μg/L)PⅢNP(μg/L)对照组1089.2±11.321.4±2.321.6±3.51.9±0.4模型组9270.9±14.6①89.4±14.4①74.7±14.4①5.8±1.4①小剂量组10259.8±24.7①88.0±12.6①70.8±22.5①5.2±0.5①中剂量组9189.7±20.2①②80.1±26.7①67.4±15.3①5.2±0.7①大剂量组9152.4±17.5①②50.1±14.4①②65.8±14.7①4.9±0.3①②

2.3 各组大鼠肝组织病理学表现 见图1。在对照组，在汇管区可见肝细胞少量表达α-SMA和胶原蛋白；在模型组，在纤维化区域可见α-SMA和胶原广泛高表达；在药物干预组，在肝纤维化区域炎细胞显著减少，α-SMA和胶原蛋白表达显著减弱(图2、图3、表3)。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现(Masson，40×)

图2 各组大鼠肝组织I型胶原表达(免疫组化，40×)

图3 各组大鼠肝组织III型胶原表达(免疫组化，40×)

表3 各组大鼠肝组织蛋白表达比较

3 讨论

肝脏长期受到各种有害因素的刺激后形成难以修复的损伤，即HF的形成，继续发展可形成肝硬化，进一步导致门脉高压、肝衰竭、肝性脑病、肝细胞癌等一系列并发症[11]。研究显示HF的过程是可逆的，早期药物干预可延缓或阻止各种慢性肝病的进展，降低肝硬化的发生率[12,13]，故研究治疗HF的药物势在必行。

本实验在模型组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平显著升高，可能由于CCl4是一种典型的肝脏化学性毒物，长期、多次皮下注射进入肝细胞，经肝细胞p450酶途径代谢产生大量的CCl3自由基等活性代谢物，使细胞或组织所处的氧化还原稳态环境被破坏，抗氧化酶的活性降低，同时这些活性代谢物攻击肝细胞膜上的磷脂分子，启动脂质过氧化的作用，导致肝细胞变性、坏死[14,15]，肝细胞膜通透性增加甚至破裂，胞浆和线粒体内的ALT和AST释放出来，同时肝损伤会发生胆红素代谢紊乱，故血清TBIL相应升高[16]。模型组肝组织可见大量的纤维间隔和假小叶形成，胶原增加，LN、HA、PIIINP、CIV水平显著升高，证明建立了稳定的HF模型。相关文献研究显示血清ALT、AST和TBIL的活性与肝损伤程度呈一致性[17]，LN、HA、PIIINP、CIV水平与HF病变程度呈现一致性[18]。本实验与文献研究报道相符合。经过额力根II号治疗后，大、中剂量组不同程度的减轻了肝损伤，降低了血清ALT、AST、TBIL、HA、PIIINP、CIV水平，肝组织病理学改变呈缓解趋势，且与药物剂量有依赖关系。由此表明中、大剂量的额力根II号对HF有一定的保护作用，但是关于其抑制了一条还是多条炎症传导通路有待进一步研究。

在正常情况下，肝组织HSCs处于静止状态，表达α-SMA非常少。α-SMA作为HSCs的标志物，其表达程度越高代表HSCs活化越显著。本实验在模型组肝组织α-SMA、Collagen I和Collagen III表达增强，主要由于肝脏受到CCl4损伤后产生的各种炎症介质诱导HSCs活化，有大量的α-SMA表达，在活化过程中分泌大量的ECM，导致ECM合成与降解失去平衡[19,20]，故模型组肝组织α-SMA、Collagen I、Collagen III表达显著增强。经过药物干预后，在中、大剂量药物干预组，肝组织α-SMA、Collagen I和Collagen III表达减弱，而且α-SMA表达变化趋势与Collagen I和Collagen III同步，主要分布在汇管区，说明额力根II号可抑制HSCs激活，使α-SMA的表达降低，减少了ECM中Collagen I和Collagen III的表达，减少了胶原沉积，发挥了抗纤维化的作用，但是关于其抑制HSCs的活化机制需体外培养HSCs进一步验证。

本实验存在以下不足：1)与模型组相比较，中、大剂量药物干预组大鼠血清LN水平和部分肝功能指标无显著改变，可能与样本量小或者大鼠的自身差异等因素有关，故在以后研究中需扩大样本量或开展多中心研究，尽量减少误差；2)本实验研究显示额力根II号具有抗纤维化的作用，但是未对额力根II号药物的副作用、不良反应等相关指标进行监测，故关于药物的安全性、副作用等方面需要后续深入研究；3)HF的发病机制非常复杂，是肝损伤后的机体整体参与的修复反应，涉及多个炎症介质的参与，故以后应深入进行基础研究，比如采用PCR、蛋白质印迹法和流式细胞术等技术多层次、多角度从药剂、药理、动物模型、细胞分子水平等水平研究药物的作用机制，完整、清晰地表述其抗纤维化的作用机理。

蒙药额力根II号对CCl4诱导的HF大鼠具有保护作用，其机制可能与抑制了HSCs活化，减少了ECM的合成有关。