原发性肝癌患者术后外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞水平与复发转移的相关性

何清 李阳 姜里航 邓盼盼 刘伟 缪宇飞

手术是肝细胞癌的主要治疗手段，但疾病术后较高的复发转移率一直是影响患者远期疗效的关键因素[1]，故早期预测肝细胞癌术后复发转移风险意义重大。同种异体自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)是天然免疫关键组成部分，参与了病毒感染细胞与肿瘤细胞的清除[2]，研究发现，肝细胞癌患者肿瘤细胞免疫逃逸与NK细胞功能缺陷息息相关[3-4]。肝癌患者机体免疫功能低下，除NK细胞分布发生改变外，患者T淋巴细胞亚群水平也有变化，而这种变化在一定程度上会影响到NK细胞的活性[5]。二者相互作用参加并推动了肝细胞癌的发生与发展，但是否与患者术后复发转移相关尚无定论。本研究观察原发性肝癌患者术后外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞水平在复发转移患者中的表达，旨在分析二者间的关系，以指导临床。

资料与方法

一、一般资料

回顾分析，选择2017年3月至2019年3月期间接受肝切除术治疗的58例原发性肝癌患者作为研究对象，根据患者术后随访复发情况将其分为复发转移组与未复发转移组，其中复发转移组21例，未复发转移组37例。全部患者的临床资料完整，且均经组织病理学确诊为原发性肝细胞癌，排除合并其他恶性肿瘤疾病的患者、合并原发性免疫功能障碍的患者、因其他疾病导致的免疫功能低下的患者，全部患者6个月内均未接受免疫调节治疗。复发转移组21例患者中男性患者13例，女性患者8例；年龄37～75岁，平均(54.12±2.01)岁；肝功能Child-Pugh评级[6]：A级17例，B级4例。未复发转移组37例患者中男性23例，女性患者14例；年龄38～75岁，平均(54.22±1.96)岁；肝功能Child-Pugh评级：A级30例，B级7例。两组一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)，有可比性。

二、研究方法

全部患者均接受外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞水平表达检测。

(1)主要仪器与试剂：全部仪器与试剂均由美国Beck-man coulter公司提供，包括Coulter QPREP自动溶血仪、Epics XL型流式细胞仪、鼠抗人单克隆抗体CD4/CD3/CD8/CD45，ABC溶血素。

(2)外周血采集方法：患者晨起后空腹状态下采集外周血5 mL，对采集得到的血样本行密度梯度离心，分离血浆与血清。

(3)T淋巴细胞亚群检测：吸取100 μL抗凝血分别经荧光素标记的各鼠抗人单克隆抗体混匀，避光在室温下反应30 min，60 min内上机测定结果，计算CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+，主要比较各组患者的CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+表达。

(4)NK细胞水平检测：收集上层血浆灭活后采集单核细胞层的细胞，向内加入生理盐水以重悬，后按照步骤进行细胞培养、细胞收获、细胞质控，最终得到NK细胞的纯度与表达。

三、统计学分析

结 果

一、两组患者外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞水平比较

复发转移组CD3+、CD3+/CD4+、NK细胞表达均低于未复发转移组，CD3+/CD8+表达高于未复发转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组外周血T淋巴细胞亚群相关指标、NK细胞水平比较(±s)

二、外周血T淋巴细胞亚群各指标、NK细胞水平与原发性肝癌复发转移关系的线性回归结果

将外周血T淋巴细胞亚群各指标及NK细胞作为自变量，原发性肝癌患者术后复发转移作为因变量，行线性回归分析结果显示，CD3+与原发性肝癌患者术后复发转移无关，CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、NK细胞水平变化可能是原发性肝癌患者复发转移的影响因素，得到线性回归方程：Y=0.904+0.049X2-0.088X3+0.063X4。见表2。

表2 外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞水平与患者复发转移关系的线性回归结果

讨 论

肿瘤的发生发展与免疫功能状态的异常改变有关，淋巴细胞反映并参与了机体免疫功能，参与了抗肿瘤免疫反应，正常的免疫状态是机体抗肿瘤的关键机制[7-8]。研究认为，免疫状态异常不仅参与了肿瘤的发生，还可能与肿瘤的转移复发有关[9]。

目前T淋巴细胞亚群较常见的指标多为表面抗原，有CD3、CD4、CD8等，其中CD4是一种外周血特殊淋巴细胞，是主要的辅助性淋巴细胞；CD8则是淋巴细胞毒性主要标志物；CD3为所有T淋巴细胞亚群的代表及标志[10-11]。CD3+与CD4+的比值、CD3+与CD8+的比值能够直接反映宿主机体T淋巴细胞亚群的平衡状态，是临床用于评估机体细胞免疫功能状态的关键性标志物[12]。除外周血T淋巴细胞亚群外，NK细胞也被用于机体免疫活性的评价，是一种主要的非特异性免疫活性细胞，具有非抗体依赖性细胞毒性，多用于各类肝炎、肝细胞癌、健康人群免疫活性检测与对比，能够反映不同人群的细胞免疫平衡状态差异，现多用于各类肝炎与肝癌鉴别诊断[13-15]。恶性肿瘤患者机体免疫力低下，T淋巴细胞亚群与NK细胞分布均发生变化[16]。早在2005年，周启明等[17]研究发现，肝癌细胞可以大量生成并分泌出免疫抑制因子，导致NK细胞活性下降；其次，因CD3+/CD4+主要为辅助性T细胞，可分泌大量炎性因子，如白细胞介素-12等，这对增强NK细胞的活性有一定意义，一旦该细胞功能降低，将影响到NK细胞活性，故机体免疫力受损。可见外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞之间存在相互影响、相互作用的关系，二者虽已被证实参与了原发性肝细胞癌的发生发展[18]，但是否与患者术后复发转移有关尚未证实。本研究结果显示，复发转移组CD3+、CD3+/CD4+、NK细胞表达均低于未复发转移组，CD3+/CD8+表达高于未复发转移组，初步提示外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞水平异常变化引起的免疫状态异常可能参与了肝细胞癌术后复发转移。进一步行回归检验结果显示，CD3+与患者术后复发转移无关，而CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、NK细胞均可能参与了肝癌患者术后复发转移。究其原因，肝癌患者术细胞免疫功能受抑制，即使是接受手术治疗，在术后患者机体内各有毒物质未被及时有效的清除，为癌细胞的增殖与生长创造了有利的免疫环境，故术后复发转移风险提高，可见肝癌术后复发转移是机体免疫功能紊乱的延续。但因本研究尚无较多循证依据支持，加之研究为回顾分析类，得到的资料、信息等均可能与实际有偏差，结果可能存在偏倚，研究尚有局限，还需要在未来进一步分析研究加以验证。