石墨烯基第三代电化学酶生物传感器

张 玲, 陈红壮, 陈 雪, 徐佳佳, 任志宇, 潘 凯, 张 谦

(1. 沈阳师范大学 化学化工学院, 沈阳 110034;2. 黑龙江大学 化工与材料学院, 哈尔滨 150080; 3. 辽宁大学 化学院, 沈阳 110036)

0 引 言

电化学酶生物传感器是将酶反应特异性与电化学信号传导结合起来的一种传感器[1]。电化学酶生物传感器具有成本低、易于使用、结构简单、灵敏度高、线性范围宽等优点。

根据不同的媒介体, 电化学生物传感器的发展历史可分为三代。 在第一代生物传感器中, 氧气充当酶和电极之间电子传递的中介[2]。 然而,第一代生物传感器存在着应用电势过高、氧气干扰、制备过程复杂等缺点。 第二代生物传感器借助电子媒介体进行电子传递, 克服了第一代传感器的一些缺点, 如消除了对氧气的依赖、显著降低了应用电位等。 然而,电子媒介体在促进了电极和酶之间的电子转移的同时, 也促进了各种干扰反应[3]。 在第三代生物传感器中,电子转移可以直接在电极和氧化还原蛋白之间进行[4]。 氧化还原蛋白本身作为电催化剂, 可促进电极和底物分子之间的电子转移,在这一过程中不涉及媒介体。 与基于媒介体的生物传感器不同, 直接电子转移使这种生物传感器具有更好的传感器性能, 主要表现在抗干扰性强、生物相容性好、灵敏度高、反应体系简单等方面。

近年来,在第三代生物传感器的构建方面,人们一直致力于开发通用、稳定的、能够保持蛋白质活性的载体作为电极修饰材料以促进氧化还原蛋白质的电子转移。研究表明,碳纳米材料具有导电性强、生物相容性好等特点,是一种很有发展前景的蛋白质载体材料。

相比于碳纳米管等其他碳纳米材料,石墨烯具有更优越的电性能和更大的比表面积[5]。石墨烯不仅可以作为连接电极表面和酶的“连接臂”以实现电子转移,还可以增强电化学信号的响应。然而,石墨烯在水中分散度不足,疏水性较强,容易形成不可逆的团聚体[6],极大地限制了这一材料的应用。因此,石墨烯的功能化成为生物传感器开发中的关键一步。在适当功能化的基础上,将各种官能团引入到石墨烯表面,不仅使石墨烯具有亲水性和生物相容性,而且可以赋予石墨烯新的功能。基于此,本文将重点介绍几种不同材料修饰的石墨烯基电化学酶生物传感器。

1 不同材料修饰的石墨烯基电化学酶生物传感器

1.1 有机分子修饰的石墨烯基酶生物传感器

有机分子表面活性剂是分散石墨烯的常用稳定剂。研究发现,表面活性剂的疏水尾部可以通过疏水作用吸附在石墨烯表面,而亲水头则朝向水相。由于表面活性剂分子的吸附,改性石墨烯是稳定的,通过静电力互相排斥聚集,可以有效防止石墨烯的重新聚集。例如:2012年,Wen[7]利用表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与石墨烯制备了一种高灵敏度的一氧化氮(NO)生物传感器。该生物传感器的制备方法如图1所示。该生物传感器对NO的检出限可达6.75×10-9M。

图1 Hb-CS/GR-CTAB/GCE的组装示意图Fig.1 Scheme of the assembly process of Hb-CS/GR-CTAB/GCE

除了非共价方法,利用化学还原石墨烯或氧化石墨烯上存在的含氧官能团,通过共价修饰也可以将有机分子修饰到石墨烯上。例如:Zheng等[8]通过共价改性制备了3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)功能化石墨烯。其中,APTES既可作为石墨烯的分散剂,又可作为气相色谱电极和石墨烯的胺类表面改性剂。以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)为交联剂,将葡萄糖氧化酶(GOD)共价键合到石墨烯功能化电极上,制成GOD/APTES-graphene/GC电极。在商业人工血糖检测的线性标准范围1.4～27.9 mM内,进一步验证了所开发的生物传感器对血糖的检测效果,它可作为糖尿病血糖监测的理想选择。同时,该生物传感器表现出良好的稳定性,当生物传感器在室温下的干燥状态下储存时,前3周生物传感器响应信号没有下降,后2周的信号只下降了12%。

1.2 聚合物修饰的石墨烯基酶生物传感器

将聚合物与石墨烯复合,由于石墨烯可以在聚合物基体中形成导电网络,因而复合材料会表现出较石墨烯更好的导电性能。不同的研究小组已经用不同的聚合物对石墨烯进行了表面修饰,以构建第三代电化学酶生物传感器[9-11]。

2019年,Zhang等[12]采用一步电沉积的方法制备了电化学还原氧化石墨烯-聚赖氨酸复合膜(ERGO-PLL)。以ERGO-PLL为载体,通过固载葡萄糖氧化酶(GOx)构建了葡萄糖传感器,并研究了其直接电子转移性能和酶催化活性。循环伏安扫描结果表明,GOx表现出一对明确的可逆氧化还原峰,通过计算得到该传感器的电子转移速率常数为18.7 s-1,这表明固载于ERGO-PLL的GOx与底层电极之间成功实现了直接电子转移。此外,该酶生物传感器具有良好的电催化活性,线性检测范围为0.005～9.0 mM,检出限为2.0 μM。

1.3 无机纳米粒子修饰的石墨烯基酶生物传感器

研究表明,将无机纳米粒子与石墨烯复合制备得到的新型材料,可以协同加速固定化酶与电极表面之间的电子转移,降低电化学过程中的过电压,进一步提高石墨烯的电化学性能。各种无机纳米粒子已被纳入到石墨烯复合物的二维结构中[13-15]。

2010年,Dey等[16]开发了以铂纳米粒子-石墨烯纳米复合材料为电极材料固载胆固醇氧化酶(ChOx)和胆固醇酯酶(ChEt)的双酶传感器。该生物传感器的制备方法如图2所示,即采用H2PtCl6在水溶液中原位还原的方法,用铂纳米粒子修饰石墨烯纳米片。结果表明,纳米复合修饰电极能在0.4 V电位下有效催化H2O2电化学氧化,其正电位相对于Pt电极少100 mV以上。所制备的生物传感器可以对胆固醇和胆固醇酯进行线性响应,线性范围宽,灵敏度高。

图2 (a) 石墨烯纳米片-Pt基生物传感器对胆固醇酯进行生物传感的机理; (b) 铂纳米粒子修饰石墨烯纳米片的FESEM图像; (c) 胆固醇酯生物传感器的安培响应

1.4 生物分子修饰的石墨烯基酶生物传感器

生物分子改性的石墨烯已经作为电极材料用于构建性能优异的生物传感器[17-18]。

2018年,Silva等[19]基于还原氧化石墨烯(rGO)和乙酰胆碱酯酶(AChE)开发了一种新型、灵敏的电化学生物传感器,并成功应用于食品样品中农药胺甲萘的检测。在最佳的微分脉冲伏安条件下,获得了纳米摩尔的检出限,实现了番茄中胺甲萘的测定。实验表明,乙酰胆碱酯酶可以有效地固定在还原氧化石墨烯表面,这为农药分析提供了一种低成本的传感器。

1.5 基于石墨烯碳纳米管的酶生物传感器

碳纳米管(CNTs)和石墨烯作为一维和二维纳米碳材料的代表,在结构和性能上是互补的[20]。例如,化学还原的石墨烯通常导电率约为100～200 Sm-1,比导电的单壁CNTs(通常为1×104Sm-1)低2个数量级。近年来,通过一维碳纳米管和二维石墨烯的结合设计的层次结构复合材料在电化学领域已被广泛应用[21]。研究发现,CNTs不仅可以有效地增加石墨烯的间距,防止纳米片的不可逆团聚,还可以弥补石墨烯与石墨烯之间的电子转移缺陷,增加电解液与电极的接触面积[22]。

2020年,Zou等[23]利用离子功能化石墨烯(G-IL)和CNTs制备了一种具有稳定三维结构的复合材料,开发了一种新型双酶葡萄糖传感器。其主要工作是通过氧化石墨烯的环氧基团与离子液体的胺基发生亲核开环反应,将正电荷引入石墨烯表面,使其表面形成正电荷层,静电斥力使石墨烯层间间距增大,阻止石墨烯片团聚,进而将石墨烯成功剥离成单层,从而在水中具有极佳的分散性。G-IL与CNTs共混后,形成了三维结构,CNTs像导线一样插入石墨烯薄片之间,进一步提高了石墨烯的分散性和稳定性。其中,石墨烯片为固定2种酶提供了较大的表面积,碳纳米管显著降低了电子转移电阻。在固载葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶之后,该葡萄糖传感器对葡萄糖显示出良好的电催化活性,响应范围为0.004～5 mM,检出限为3.99×10-7M。

1.6 杂原子掺杂石墨烯基酶生物传感器

元素掺杂是调整石墨烯本质性质的有效策略。研究表明,掺杂石墨烯可以调整石墨烯的电子性能[24-25]。以N掺杂石墨烯材料为例,氮掺杂石墨烯表现出与未掺杂石墨烯截然不同的电子性能。2010年,Wang等[26]首次构建了一种氮掺杂石墨烯基电化学生物传感器用于测定葡萄糖。其中,氮掺杂石墨烯是通过氮等离子体处理化学还原石墨烯而得到的,该方法具有简单、快速、可调等特点。通过控制等离子体暴露时间,可以很容易在0.11%～1.35%调节氮掺杂率。制备的N掺杂石墨烯具有良好的电催化活性。在H2O2还原方面,与气相色谱电极相比,N掺杂石墨烯电极在循环伏安图中的还原峰正移400 mV,电流增强20倍。固载葡萄糖氧化酶(GOD)后,在N掺杂石墨烯-GOD电极上可以得到一对明确的、准可逆的氧化还原峰,对应于氧化还原酶的直接电化学反应。由于N掺杂石墨烯的费米势发生了变化,且通过掺杂提高了电子转移效率,因而N掺杂石墨烯基酶电极获得的氧化还原峰电流远高于未掺杂石墨烯电极。由于N掺杂石墨烯具有良好的生物相容性和导电性,该生物传感器表现出较高的灵敏度和选择性,可用于浓度低至0.01 mM的葡萄糖的检测。

2 结 论

用CTAB等有机分子、聚赖氨酸等聚合物、Pt等无机纳米粒子、乙酰胆碱酯酶等生物分子、碳纳米管等对石墨烯进行修饰,或者通过氮等杂原子掺杂可以有效实现石墨烯的功能化。石墨烯功能化拓宽了石墨烯在第三代电化学酶生物传感器中的应用范围,使得石墨烯基电化学生物传感器在临床诊断、卫生保健检测和环境监测方面具有巨大的应用前景。

致谢感谢沈阳师范大学化学化工学院大学生创新创业训练项目的支持。