大豆分离蛋白基生物医用材料的制备和应用前景分析

王瑞瑞

(青海师范大学 化学化工学院，青海 西宁 810016 )

大豆是世界上利用最为广泛的豆类作物之一，具有营养价值高、价格低廉、来源丰富等特点。大豆分离蛋白(SPI)是一种来源于豆粕且具有较高商业价值的大豆蛋白产品。由于来源于植物体，消除了传播疾病的风险，SPI是一种公认的安全化合物(GRAS)。随着能源危机和环境污染的日益加剧，充分利用SPI来源丰富、生物相容、可再生、可生物降解等特点，开发性能优良、附加值高的蛋白质基生物医用材料能够有效减少石油衍生聚合物的使用，从而减轻环境污染。SPI基生物医用材料的开发解决了传统合成类高分子材料的使用安全问题，利于豆类作物的高值转化，已成为研究热点。

1 大豆分离蛋白的结构与性质

SPI由球蛋白(11S)和β-伴球蛋白(7S)组成。7S由三个亚基α、α′和β构成。11S是六聚体，见图1。

图1 球蛋白分子的结构示意图[1]Fig.1 Schematic diagram of glycinin molecule(11S) [1]

酸性亚基A和碱性亚基B通过静电和氢键连接成两个六角形环，形成一个空心圆柱体。11S在一定的pH或受热条件下可以分解成7S[1]。SPI中含有8种人体必需氨基酸(异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)，能够有效平衡机体内氨基酸的组成，胆固醇含量低，可有效降低高血压、心脑血管疾病的患病风险[2]。与其他天然蛋白相比，SPI具有优良的胶凝、发泡、抗氧化能力和优异的生物相容性，被广泛用于各种功能食品和包装材料的制备[3]。近年来，人们发现SPI富含的精氨酸和谷氨酸能够强健和修复受损基因，促进机体新陈代谢和受损细胞新生，具有较强的伤口愈合能力。同时，SPI良好的表面疏水性和优异的乳化特性[4]，可以对生物活性组分(维生素D、辅酶Q10、叶酸等)进行高效负载从而用作药物载体材料[5]。SPI无需额外添加昂贵的生长因子就能够促进组织细胞再生，良好的生物相容性和低免疫原性使SPI基生物功能材料的研发及在组织再生、基因传递等生物医用领域的应用具有更强的吸引力。

但是，SPI分子结构中存在大量的氨基、羧基、羟基等基团，分子结构中以无规线团和α螺旋结构为主，因此，SPI基生物材料普遍存在耐湿性差、易脆裂和力学性能差等缺点[6]。这些缺陷极大地限制了SPI在生物医用材料领域的应用。目前，为了改善SPI基生物材料的应用性能，通常采用交联改性、共混改性等方法对SPI基生物材料进行改性处理，这些方法一定程度上改善了SPI基薄膜的使用性能，拓宽了SPI基生物材料在疏水性药物载体和创面敷料薄膜等生物医用材料领域的应用。

2 大豆分离蛋白基生物医用材料制备方法

1940年，人们就开始研究大豆蛋白基功能材料，但是，SPI耐水性和稳定性较差，材料硬脆，流变阻力大[7]。而且，SPI极强的吸水性易导致微生物滋生等问题，限制了其作为生物医用材料的开发应用。为了克服SPI固有的缺点，拓宽SPI基生物功能材料在医用领域的应用范围，通常需要对SPI进行改性处理。

2.1 交联改性法

交联改性法是豆类蛋白结构的主要修饰策略，也是开发新型SPI基生物医用材料的主要手段[7]。同胶原蛋白一样，物理、化学和酶促交联改性均可以赋予SPI基蛋白材料致密的交联网状结构，有效提高SPI基蛋白医用材料的机械强度。SPI可以通过热交联、辐照交联、化学交联和酶促交联，使SPI分子结构中的—NH2、—OH、—SH等活性基团发生交联反应。最有效的SPI交联剂为甲醛和戊二醛，但是这两种交联剂改性的SPI基生物功能材料具有潜在的生理毒性，在实际应用中受到了限制。Peles等[8]研究了以乙二醛和ι-半胱氨酸为交联剂制备SPI改性蛋白膜。结果表明,乙二醛和ι-半胱氨酸交联改性SPI膜具有优异的机械性能和药物缓释性能，可以有效预防细菌感染，促进伤口愈合。这种独特的交联网状结构可以用作烧伤和溃疡创面敷料，在伤口愈合领域具有大的应用潜力。SPI还可以与金属离子(如Ca2+)产生配位交联，实现SPI材料的改性。Vaz等[9]研究在SPI中添加三聚磷酸钙形成热塑性材料，这种材料无毒，能够促进组织细胞增殖，可以用作生物活性骨填充剂和伤口敷料[10]。交联改性方法试图建立交联致密的网络结构从而赋予SPI基蛋白材料优异的力学强度，但是这种网络结构往往伴随着材料延伸率的大幅度下降，导致材料的可塑性下降。此外，交联改性过程中，交联剂的使用所产生的细胞毒性问题一直备受争议，也极大地限制了交联改性SPI材料在生物医用材料领域的应用。

2.2 共混改性法

采用一些具有独特性能的材料对SPI进行共混改性，可以赋予SPI基蛋白材料优异的功能特性。Tansaz等[11]将纳米级生物活性玻璃和SPI进行共混制备了SPI生物降解膜，研究发现制备的复合材料对血液和渗出液具有高吸附性，为细胞增殖提供了一个理想的环境，可作为新型创面止血材料。Han等[12]研究了甘草提取物(LCR)对SPI膜的改性作用。LCR的酚羟基和SPI的活性基团之间可以形成氢键，提高了薄膜的机械性能、阻隔(阻水、阻氧、阻光)性能和抗氧化性能。Wu等[13]在SPI成膜液中加入植物源肉桂醛和合成的氧化锌纳米片，增强了SPI膜的力学性能、屏障性能和抗真菌性能。

将天然产物的活性基团和SPI分子之间通过氢键等非共价键作用产生网状结构，从而提高SPI基蛋白膜材料的机械强度，同时赋予材料抗氧、杀菌等功能特性，是目前的一个主要发展方向。Li等[14]研究用自愈型聚合物对SPI进行共混改性，以解决SPI基材料的不可逆损伤问题，可赋予材料智能特性。自愈性聚合物改性可以延长SPI基蛋白材料的使用寿命、提高生物安全性和降低维护成本，被广泛应用在组织工程领域。他们研究将SPI与聚乙烯亚胺(PEI)和金属离子Cu(II)或Zn(II)相结合，制备了具有优异自愈性和抗菌性能的高机械强度SPI基蛋白材料。PEI的链迁移率高，与SPI的非共价键结合赋予SPI基复合材料动态可逆性，即使在室温下，这些复合材料也表现出良好的自愈能力。还可以通过改变金属离子的含量和种类赋予SPI基复合材料可调性。此外，PEI和金属离子具有一定的抗菌能力，克服了SPI易受微生物侵袭污染的缺点。为研制可回收和耐用性的SPI基功能材料提供了新思路。此外，光热疗法(PTT)由于其安全性和高效性，近年来已成为一种很有前途的肿瘤手术、放疗、化疗和生物治疗的治疗方法。PTT法通常使用氧化石墨烯(GO)、碳纳米管、纳米金粒子、近红外(NIR)有机染料作为光吸收剂，可产生用于烧蚀肿瘤的局部高温。在临床应用中可以利用近红外光辐照烧蚀目标病灶的同时，有效避免了破坏病灶附近组织。Jiang等[15]以SPI和氧化石墨烯为原料，制备了SPI/GO纳米复合材料。氧化石墨烯被SPI原位还原并稳定下来，合成的SPI/rGO纳米复合材料在水中具有良好的分散性和生物相容性。可以作为一种光热剂用于癌症治疗，在抗癌药物领域具有广阔的应用前景。但是，共混改性法由于填料沉积速度不同极易造成分布不均等问题，此外，共混改性法生产效率偏低，制备过程容易造成材料污染，目前，这种方法仅限于实验室研究，在大规模工业化生产方面仍然存在一定的局限性。

SPI和多糖共混可以有效保持生物活性分子的活性，为开发功能医用保健品提供了新方向。Xing等[16]研究了SPI改性壳聚糖基薄膜的功能特性。SPI通过与活性基团(如—NH2)反应来改变SPI的分子形态，有效提高了壳聚糖基薄膜的延展性，克服了壳聚糖膜易脆和价格昂贵的缺点，成膜具有优异的抗菌性能。Han等[17]研究了由SPI、羧甲基纤维素(CMC)和儿茶素(CT)组成的复合膜材料，与纯SPI膜相比，复合膜具有更好的水溶性和抗张强度，但是复合膜的透光性、水蒸气透过率和伸长率有所下降。此外，复合膜具有一定清除自由基的能力。Deng等[18]利用热处理工艺制备了玉米纤维胶(CFG)-大豆分离蛋白(SPI)互穿网络水凝胶，CFG-SPI互穿网络水凝胶具有规则、致密的内部结构和光滑的表面。与SPI水凝胶相比，CFG-SPI互穿网络水凝胶具有更大的硬度和更好延展性。Zheng等[19]采用双醛羧甲基纤维素(DCMC)改性SPI蛋白膜，显著提高了薄膜的抗张强度，有效改善了SPI蛋白膜的耐水性，提高了SPI蛋白膜的热稳定性。Pan等[20]采用热重分析法研究了SPI-海藻酸钠复合成膜液的相分离程度与形貌、热力学性质、膜性能之间的相关性，为设计功能性SPI基蛋白材料提供了理论依据。目前，利用多糖共混改性制备的SPI蛋白膜材料多用于开发功能型可食包装材料，由于无法有效地解决SPI蛋白膜材料的耐水性问题，限制了其在生物医用领域的应用。

将两种蛋白质共混可以有效改善SPI胶束的流变性，是目前的研究热点。Beliciu等[21]研究了热处理的酪蛋白-大豆蛋白复合胶束的相容性和流变性。热处理可能引起两种蛋白之间的相互作用，这种相互作用的强度取决于单个蛋白质的分子结构和构象。结果表明，经热处理的酪蛋白-大豆蛋白胶束具有复杂的流变学行为。当大豆蛋白浓度超过临界胶凝浓度时，由于温度超过大豆蛋白的变性温度，酪蛋白-大豆蛋白复合胶束通过二硫键诱导聚集和胶凝；当大豆蛋白浓度小于临界胶凝浓度，可以得到粘度较低、储存稳定性好的牛顿液体。热处理的酪蛋白-大豆蛋白胶束为设计具有一定质感和口感的功能保健材料提供了技术依据。但是，利用蛋白质共混改法在SPI基生物材料制备过程由于异源蛋白质相容性差极，易产生微相分离，导致材料耐水性、机械强度、透光性等应用性能无法得到有效改善，极大地限制了SPI基蛋白材料在生物医用材料领域的应用。

2.3 复凝聚法

SPI和离子型多糖之间不仅可以产生美拉德反应，还能产生强的静电吸引相互作用，这为大豆分离蛋白基生物医用材料的设计和开发提供了新思路。淀粉、纤维素、葡聚糖、壳聚糖和阿拉伯木聚糖等多糖均可以与SPI组装改性，提高乳化性能和稳定性[4]。许多研究者研究了蛋白质和离子型多糖之间形成的凝聚物。Yuan等[22]研究用SPI和壳聚糖(CS)在pH 3.0的体系中，121 ℃加热15 min制备了可溶性的SPI-CS凝聚物，这种凝聚物形成的主要驱动力为静电相互吸引作用力，壳聚糖的存在有效提高了SPI在酸性体系的溶解度，赋予了材料优异的抗菌性能。Jin等[23]通过光催化制备了SPI-果胶纳米粒子(SPP)，SPI和果胶在光催化下自组装成球形纳米粒子。结果表明,SPP可以作为新型的皮克林乳化剂，经SPP稳定的乳状液具有较高的热稳定性、良好的耐盐性和良好的冻融稳定性。Hu等[24]选用黄原胶和角叉菜胶两种负电荷多糖与SPI在加热条件下自组装制备了生物聚合物。自组装主要的驱动力来自静电相互吸引作用力。制备的生物聚合物可以延长其在胃液中的消化时间，可用于减肥等功能饮品的开发。复凝聚法简单易行，是开发SPI基自组装生物医用材料的一种有效方法。

2.4 自组装法

蛋白质具有高度自组装特性，因此，通过研究SPI的自组装行为，利用自组装方法制备性能优异的SPI基自组装生物医用材料是一种安全、高效、可行的策略。Nishinari等[25]为了揭示大豆球蛋白在加热过程中展开多肽链的自组装过程，研究了β球蛋白和球蛋白在pH 7.0的热聚集动力学，阐明了可溶性和不溶性聚集体之间的相态差异。见图2，β球蛋白和球蛋白组装体的粒径均随加热温度的升高而增大，β球蛋白/球蛋白组装体的粒径随β球蛋白含量的增加而减小，与β球蛋白可溶性聚集体不同，球蛋白不溶性聚集体具有密度较大的核和密度较小的壳，聚集体粒径较小。结果表明,β球蛋白终止了球蛋白不溶性团聚体的生长，这是由于β球蛋白与球蛋白中可溶性的碱性多肽相互作用，从而提高了球蛋白的溶解度。何秀婷等[26]研究了在11S和7S在不同条件下的自组装过程，结果表明,在低pH值、低离子强度的自组装条件下，随着组装体浓度的增大，大豆蛋白更易发生纤维化聚集，7S比11S更易形成纤维化聚集体。在酸性环境下，11S纤维化聚集程度越高，越有利于热致凝胶网络结构的形成。相同条件下，11S自组装凝胶的结构有序性和凝胶强度均大于7S自组装凝胶。通过对大豆分离蛋白自组装动力学、影响因素的研究，将加深对不同条件下大豆分离蛋白结构的认知，为大豆分离蛋白基生物医用材料的开发提供依据。

图2 β球蛋白/球蛋白热聚集示意图[25]Fig.2 Schematic diagram of the thermal aggregation of β-globulin/globulin[25]

Pan等[27]采用静电层层自组装法将带正电的N-(2-羟基-3-氯化三甲铵基)丙基壳聚糖(HTCC)和带负电的SPI交替组装在醋酸纤维素(CA)电纺纤维毡上。通过自组装法制备的HTCC/SPI双层纳米纤维具有更加规整的三维结构，可作为生物医用敷料和功能食品包装材料使用。Norouzi等[28]采用SPI水凝胶对聚对苯二甲酸乙二醇酯织物(PET)进行表面改性，将丙烯酸(AA)接枝聚合在PET织物表面，用碳二亚胺(EDAC)活化丙烯酸酯结构中的羧基，在PET织物表面涂覆SPI。PET织物作为基材对SPI水凝胶起支撑保护作用，有效改善了SPI水凝胶的机械强度。可用于制备新型创面敷料，还可以负载加巴喷丁用于糖尿病溃疡的治疗。

Chen等[29]研究了体系温度、pH值、蛋白质浓度对SPI自组装过程的影响。见图3，在室温下，SPI分子自组装形成的粒子尺寸随着pH值的降低而增加。随着温度的升高，SPI自聚体发生部分分解。当温度进一步升高，SPI分子发生变性，从而形成更大的聚集体，进而形成凝胶。Chen等[30]还研究了NaCl浓度对大豆蛋白分子自聚的影响。结果表明,在一定温度下，凝胶速率随离子强度、蛋白质浓度和聚集体粒径的增加而显著提高。凝胶硬度不受聚集体大小和离子强度的影响，但随着蛋白质浓度的增加而显著增加。与热诱导的天然大豆蛋白凝胶相比，NaCl诱导SPI自聚体的凝胶速度更快，并且可以在较低的蛋白浓度和温度下发生。天然大豆蛋白热凝胶和盐诱导凝胶的硬度无明显差异，但是，后者的活化能更小，结构更均匀。张娜等[31]研究了不同pH值条件下制备了大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽自组装产物。利用荧光光谱对自组装产物的抗氧化性能进行了分析。结果表明,随着体系pH值的变化，处于极性环境中的色氨酸残基逐渐向大豆蛋白肽-酪蛋白非磷酸肽组装产物分子内部的非极性环境中转移，伴随着荧光强度的变化，自组装产物的抗氧化能力较高，在pH 6.0时达到最大。Zhang等[32]首次通过超声诱导的分子自组装成功制备了双功能大豆肽纳米颗粒(SPN)，该颗粒来源于水解过程中形成了大的不溶性肽聚集物。SPN呈球形，粒径小、分布均匀。SPN能够有效覆盖在油水界面，使乳液具有良好的抗聚结稳定性。SPN对脂质氧化具有较好的抑制作用，可以作为一种新型的双功能乳化剂。Li等[33]以过硫酸铵为引发剂、巯基乙酸作为蛋白质变性剂合成热响应性接枝共聚物[SPI-g-poly(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPA)]，研究了其在水溶液中的自组装行为。SPI-g-PNIPA接枝共聚物的形态与体系浓度、温度、pH值、离子强度有关，表现出简单的球形结构、球形核壳结构和随机的线圈结构。近年来，球状蛋白(大豆蛋白、乳清蛋白、牛血清蛋白和卵清蛋白等)的自组装研究在生物医学领域和功能食品领域已成为研究热点[34]。

2.5 熔融铸造法

目前，熔融铸造法是SPI基蛋白材料工业化生产的主要方法。该方法包括挤压、热压和注塑三个阶段。在高温、高压和化学剪切力的作用下，SPI发生变性，溶解度降低，转化为连续的塑性熔体，然后通过模具塑化形成连续的型材。熔融铸造法可以获得强度较大的SPI基材料，但是通常需要加入大量小分子的增塑剂(多元醇、酰胺、羟胺等)提高SPI的可塑性[35]。由于大量小分子增塑剂的使用会导致SPI基蛋白材料的耐水性和透光性变差，而且熔融铸造法需要的设备投资成本大、能耗高，经济收益低。

3 大豆分离蛋白基生物医用材料的发展前景

大豆分离蛋白(SPI)价廉易得、来源广泛，具有优异的生物相容性和良好的生物降解性等特点，是集富集、缓释和靶向于一体的理想载体，开发以SPI为基材的天然高分子多功能纳米载药体系能够有效提高疏水性药物的溶解度，控制药物释放率和提高药物的生物利用率，在药物输送和制药领域具有广阔的应用前景。此外，SPI基医用敷料具有较强的保水性、一定的结构灵活性和合适的机械性能、透气性能和抗感染性能，并且具有优异的生物相容性，能够保持创面的湿润环境、防止继发性损伤、为细胞迁移和感染清除提供微环境，是制备创面敷料的理想材料。今后的研究应致力于研发操作简便、成本较低并且对环境无毒无害的SPI基生物医用材料制备方法，在赋予其优异性能的同时有效改善SPI基生物医用材料的耐水性、可塑性和稳定性。