以9-蒽醛为荧光基团的吡唑啉衍生物荧光探针对Fe3+和Cu2+的检测

罗杰伟 赵 波 张仕禄 贾飞云 刘 军

(川北医学院基础医学院，南充 637000)

到目前为止，许多测量技术如原子吸收光谱法、核磁共振分光光度法和荧光技术等已经被广泛用于生物遗传、药物控制释放、工业传感和环境监测等领域。其中，荧光化学传感器以其灵敏度高、响应速度快、检出限低、实时监测等优点引起了研究者的极大兴趣[1-8]。在重金属离子中，Fe3+和Cu2+是生物系统内最重要的微量元素，参与了细胞水平上的许多生物和化学过程，如载氧活性、细胞代谢、酶促反应和各种生物合成等，但是体内Fe3+和Cu2+过多却会给人的身体健康带来伤害[9-10]。如Fe3+过多或缺乏可能导致免疫力低下、智力降低和抗感染能力降低，甚至诱发各种疾病等[11]。过量的Cu2+会在肝脏和脑组织内积聚，从而引起肝硬化和腹水等疾病，甚至会发生肝昏迷而死亡，也会导致语言不清、呆笑等病症[12]。此外，在工业或者生活污水中的铁、铜含量过高会造成严重的环境污染。因此，Fe3+/Cu2+对环境的污染和人体健康的危害日益受到了人们的广泛关注。但开发高灵敏度、高选择性的荧光化学传感器应用于生物和环境系统监测Fe3+/Cu2+仍然是一个巨大的挑战[13-16]。

吡唑啉衍生物是一类重要的五元含氮杂环化合物，在医药和农药等方面有着优良的生物活性和重要应用，它们具有抗病毒、消炎、杀灭真菌、抗菌以及抗癌等广泛生物活性[17-19]。吡唑啉环1位上N原子是分子作为电荷转移的电子供给源，而与3位上碳原子的相邻处则为电子接收部位，1、3位连有芳基时可构成较大的π共轭体系。此外，吡唑啉环中2个氮原子的电子云密度较高，可作为电子给体，易于与电子受体化合物发生电子转移。吡唑啉衍生物因分子内存在大π共轭体系而具有良好的光学性质，可通过荧光光谱法检测各种金属离子[20-21]。因此，研究者通过在吡唑啉环上引入不同官能团改变分子内电子转移的机制，从而丰富其分子结构和拓宽其在离子识别方面的应用，但目前关于吡唑啉衍生物同时选择性识别Cu2+和Fe3+的报道还很少[22-25]。鉴于此，我们课题组合成了一种荧光分子探针 1，5-二苯基-3-(10-(吗啉甲基)蒽-2-基)吡唑啉(PMAP)，研究了探针PMAP的离子识别性能,测定了PMAP在Fe3+、Cu2+和H+不同组合条件下的量子产率,考察了PMAP在实际水样中检测Cu2+和Fe3+的效果。结果表明，荧光传感器PMAP可在环境监测和工业传感等领域通过仪器和裸眼监测和检测Fe3+/Cu2+。PMAP合成路线如Scheme 1所示。

Scheme 1 Synthesis route of compound PMAP

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

实验所用试剂均为市售分析纯试剂；金属离子溶液所用金属盐均为高氯酸盐水合物；实验用水为二次蒸馏水；溶剂均以标准方法处理。所用仪器有：Bruker 400MHz核磁共振仪(TMS为内标，CDC13为溶剂)、XT-4型双目显微熔点测定仪(温度计未校正)、CaryEclipse荧光分光光度计(美国VARIAN公司)、UV2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)、pHS-3C型酸度计、Bruker SMART 1000 CCD(德国Bruker公司)。

1.2 合 成

1.2.1 化合物1和化合物2的合成

参考文献[26]方法合成9-羟甲基蒽(1)和9-溴甲基蒽(2)，其熔点分别为161～162 ℃和126～128 ℃(文献值[26]：161～162 ℃和126～128 ℃)。

1.2.2 9-蒽甲基吗啉(3)的合成在250 mL圆底烧瓶中加入2(5 g，18.45 mmol)、无水K2CO3(7.65 g，55 mmol)、80 mL 无水 CH3CN 和少量KI，搅拌回流9 h。冷却至室温，抽滤，旋转蒸发出溶剂，用二氯甲烷和石油醚重结晶得到黄色颗粒状固体 4.1 g，产率 80.4%。m.p.143～144 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃ )：δ2.61～2.64(t，J=4.6 Hz，4H，—N—CH2—)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz，4H，—O—CH2—)，4.46(s，2H，Ar—CH2—)，7.46～7.56(m，4H，Ar—H)，8.00～8.03(m，2H，Ar—H)，8.44(s，1H，Ar—H)，8.48～8.49(d，J=4 Hz，1H，Ar—H)，8.51(s，1H，Ar—H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ53.65，54.54，67.11，76.77，77.09，77.41，124.84，124.99，125.63，127.55，128.96，129.10，131.35，131.39。

1.2.3 1-(10-(吗啉甲基)蒽-2-基)乙酮(4)的合成

250 mL三颈瓶中加入 3(1 g，3.6 mmol)、乙酰氯(1.7 g，22 mmol)和50 mL无水二氯甲烷，在冰盐浴下搅拌，温度冷却至-5～0℃时，分批加入0.96 g无水三氯化铝，拆去冰浴，搅拌至温度升到10℃。抽滤，无水二氯甲烷洗涤，粗产品缓慢加入150 mL冰和浓盐酸的混合溶液中，用二氯甲烷和水萃取，饱和Na2CO3溶液洗至pH=7，无水MgSO4干燥，抽滤，旋转蒸发出溶剂,经柱层析纯化(石油醚/二氯甲烷，4∶1，V/V)得黄色固体0.35 g，产率30%。m.p.158～160℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ2.60～2.62(t，J=4.4 Hz，4H，—N—CH2—)，2.77(s，3H，—COCH3)，3.63～3.65(t，J=4.4 Hz，4H，—O—CH2—)，4.44(s，2H，Ar—CH2—)，7.51～7.63(m，2H，Ar—H)，8.03～8.07(m，2H，Ar—H)，8.49～8.53(m，2H，Ar—H)，8.58(s，1H，Ar—H)，8.64～8.65(d，J=4 Hz，1H，Ar—H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ26.44，53.52，54.42，66.97，122.86，124.99,125.44,125.58,126.91,129.17，130.06，131.69，132.23，132.90，133.37。

1.2.4 1-(10-(吗啉甲基)蒽-2-基)-3-苯基丙基-2-烯-1-酮(5)的合成

2.嫖宿行为的构成，除了自然性交外，口交、手淫、肛交等也可构成，而奸淫行为的构成，只限于自然性交。这就意味着，在目前的情况下，强奸罪已无法容纳“嫖宿”行为，嫖宿幼女罪难以“并入”强奸罪。

100 mL圆底烧瓶中加入7 g KOH、10 mL水、50 mL 95%乙醇，冷却至室温，加入4(0.638 g，2 mmol)、苯甲醛(0.318 g，3 mmol)，在15 ℃搅拌3 h。过滤，水洗，无水乙醇重结晶得黄色固体0.51 g，产率62.7%。m.p.140～142 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3，25 ℃)：δ2.61～2.64(t，J=4.4 Hz，4H)，3.64～3.66(t，J=4.4Hz，4H),4.46(s,2H),7.46～7.47(m，3H)，7.53～7.55(m，1H)，7.59～7.63(m,1H)，7.72～7.75(m，3H)，7.90～7.94(d，J=16 Hz，1H)，8.05～8.07(m，1H)，8.11～8.12(m，1H)，8.50～8.52(m，1H)，8.56～8.58(d，J=8 Hz，1H)，8.61(s，1H)，8.725～8.73(d，J=1.92 Hz，1H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ53.55，54.45，66.99，121.75，123.52，125.02，125.43，125.82,126.90,128.42,128.92,129.19，130.10，130.13，130.49,131.71,131.88,132.27,132.88，134.39，134.90，144.58。

1.2.5 1，5-二苯基-3-(10-(吗啉甲基)蒽-2-基)吡唑啉(PMAP)的合成

50 mL 圆底烧瓶中加入 5(0.5 g，1.2 mmol)、10 mL无水乙醇，加热至溶解。加入苯肼(0.199 g，1.18 mmol)和一粒氢氧化钠，回流16 h。冷却，加适量水，析出黄色固体，抽滤，水洗，无水乙醇重结晶得0.21 g，产率35%。m.p.266～267 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ2.61～2.64(t，J=4.6 Hz，4H，—N—CH2—)，3.33～3.35(d，J=8 Hz，1H)，3.64～3.66(t，J=4.6 Hz，4H，—O—CH2—)，3.99～4.01(d，J=8 Hz，1H)，4.44(s，2H，Ar—CH2)，5.36～5.38(d，J=8 Hz，1H)，6.80～6.84(m，1H，Ar—H)，7.14～7.16(t，J=8.46 Hz，2H，Ar—H)，7.20～7.24(m，2H，Ar—H)，7.27～7.30(m，2H，Ar—H)，7.36～7.37(t，J=4.08 Hz，3H，Ar—H)，7.46～7.50(m，1H，Ar—H)，7.512～7.514(m，1H，Ar—H)，7.83～7.84(d，J=4 Hz，1H，Ar—H)，7.96～7.98(d，J=8 Hz，1H，Ar—H)，8.26～8.29(m，1H，Ar—H)，8.34(s，1H，Ar—H)，8.46～8.49(m，2H，Ar—H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ43.13，53.56，54.44，64.47，67.06，76.63，76.94，77.26，113.39，119.20，123.36，125.02，125.20，125.71,125.78,127.54,127.67,128.82，128.88，129.10，129.36,130.97,131.10,131.65,131.74，142.44，144.48，146.47。

1.3 光谱实验

称量0.004 7 g(0.01 mmol)PMAP于100 mL容量瓶中，以乙腈为溶剂配成浓度为0.1 mmol·L-1的溶液。配制浓度为0.1 mmol·L-1的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ag+、Fe3+、Ni2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Zn2+、Hg2+等离子的高氯酸盐溶液。移取0.1 mL PMAP溶液和0.1 mL金属阳离子溶液分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至10 mL，摇匀，静置24 h。室温下，以乙腈为参比，在波长为200～900 nm条件下测定混合溶液的紫外可见吸收强度；在激发波长为360 nm和狭缝宽度d=5 nm的条件下测定荧光强度。

1.4 晶体结构检测

将PMAP溶于乙腈溶液，利用乙醚挥发性析出PMAP单晶，选取合适晶体用于单晶结构测试。用Bruker SMART 1000 CCD衍射仪，选择石墨单色器单色化的MoKα射线(λ=0.710 73 nm)，在296 K下收集衍射数据。利用SAINT5.0和SHEIXTL-97[27]程序完成化合物的数据还原和数据解析。采用全矩阵最小二乘法对晶体结构进行直接法解析。氢原子坐标经差值Fourier合成得到，非氢原子坐标由直接法得到。氢原子采用各向同性热参数修正，其它原子采用各向异性热参数修正[28-29]。化合物PMAP的晶体学参数列于表1。

CCDC：2051694。

表1 PMAP的晶体学参数Table 1 Crystal data and structure refinement for PMAP

2 结果与讨论

2.1 PMAP的晶体结构

在探针PMAP的晶体结构中，C1～C6平面和吡唑啉环近似共平面(二面角为0.62°)，C8～C13平面与吡唑啉环夹角为88.6°，C8～C13几乎垂直这2个平面。而吗啉环与蒽环和吡唑啉环之间夹角分别为73.48°和67.8°(图1a)。相邻分子之间依靠C—H…N氢键和C—H…O氢键以及苯环平面之间π…π堆积作用自组装成有序的超分子结构(图1b)。

图1 (a)PMAP的30%椭球概率晶体结构图;(b)PMAP的晶体堆积图Fig.1 (a)Molecular structure of PMAP with probability level of 30%;(b)Crystal packing of PMAP

2.2 光谱分析

如图2a显示，加入Fe3+，PMAP的紫外可见吸收光谱在267和380 nm的吸光度分别从1.26、0.74上升到2.24和1.1，在610 nm出现新吸收峰，吸光度为0.27；加入Cu2+后，267 nm处的吸光度从1.26升至1.6；380 nm处从0.74降至0.3，610 nm出现峰值为0.23的新吸收峰，其它离子没有变化。图2b表明，加入Fe3+和Cu2+后，PMAP荧光强度分别在577和532 nm处发生明显猝灭，其中，加入Fe3+时发生约45 nm红移，其它离子对PMAP的荧光强度无影响。可能是Fe3+和Cu2+的软硬酸碱配位作用导致荧光猝灭，具有“on-off”开关性能。另外，加入Fe3+和Cu2+后，溶液颜色从淡黄色变为蓝色(图3)，其他离子加入后溶液颜色没有变化，即裸眼可判断探针PMAP选择性识别Fe3+和Cu2+。

图2 加入不同离子后PMAP在乙腈水溶液中紫外可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b)Fig.2 UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP with various cations

图3 加入不同离子后PMAP溶液颜色变化Fig.3 Color changes of PMAP after addition of various ions

2.2.2 紫外可见滴定和荧光滴定

鉴于PMAP对Fe3+和Cu2+具有较好识别，利用Fe3+/Cu2+对PMAP进行紫外可见滴定和荧光滴定。在Fe3+对PMAP紫外可见滴定中，267、380和610 nm处各个峰吸光度增强(图4a)。在360 nm的激发波长下，在 0～1.0 μmol·L-1范围内的荧光滴定实验中，随着Fe3+浓度增大，PMAP荧光强度从660降至193，最大峰位向长波方向移动，从532 nm移到567 nm(图4b)。红移原因可能是吡啶环上N原子参与了配位，荧光猝灭被抑制。同样，在Cu2+对PMAP的紫外可见滴定中，380 nm处峰值不断下降，在267和610 nm处强度逐渐增大，但变化程度较小(图5a)。随着Cu2+浓度的增大，PMAP在532 nm的荧光强度从937逐渐降低到0，同时在425 nm出现了一个荧光强度逐渐增大的新峰，强度从0到189(图5b)。Job曲线图显示探针PMAP与Fe3+/Cu2+配位比为1∶1，可能是PMAP能提供一个合适的空间来容纳Fe3+/Cu2+。

图4 加入不同浓度Fe3+后PMAP的紫外可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b)Fig.4 UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP after addition of Fe3+with various concentrations

图5 加入不同浓度Cu2+后PMAP的紫外可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b)Fig.5 UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP after addition of Cu2+with various concentration

2.2.3 抗酸性研究

如图6a所示，在H+对PMAP的紫外可见滴定中，在380 nm处，当pH=1～4时，峰值随pH值的增大而增大，但pH=4～7时，峰值变化较小；在610 nm处，pH=1时，强度明显降低，但pH≥2时，强度变化不大。荧光滴定发现，当pH=5～7时，荧光强度基本不变；pH≤4时，荧光强度突然骤降并红移；pH=1时，荧光完全猝灭(图6b)，说明吗啉环上的O原子、N原子以及吡啶环上的N原子容易质子化。结果表明，PMAP传感器检测Fe3+/Cu2+的pH值范围为5～7。

图6 pH值对PMAP紫外可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b)的影响Fig.6 Effect of pH value on UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b)of PMAP

2.2.4 配位干扰实验

为了排除其他离子干扰，研究了Fe3+、Cu2+与其他金属离子共存时，探针PMAP在532 nm处的荧光变化情况。结果证实，分别加入碱金属和碱土金属如 K+、Na+、Hg2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+和过渡金属如 Cd2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+后，PMAP对Fe3+和Cu2+的响应基本不受影响(图7)，说明PMAP对Fe3+和Cu2+有良好的选择性识别。

图7 在PMAP、Fe3+和Cu2+共存时加入金属离子后荧光强度变化Fig.7 Effect of coexisting ions on fluorescence intensity of the solution containing PMAP,Fe3+,Cu2+

2.3 量子产率测定

在探针 PMAP 的乙腈溶液(10 μmol·L-1)中分别加 入 Cu2+(20 μmol·L-1)、Fe3+(20 μmol·L-1)和 H+(20 μmol·L-1)，在激发波长为360 nm下测其荧光强度。以蒽(1.0 μmol·L-1)为参比(室温，Φf=0.36)，运用公式Yu=YsIuAs/(IsAu)计算量子产率(表 2)，其中Yu为待测物质量子产率，Ys为标准物质量子产率，Is为蒽的荧光积分强度，As为在360 nm时紫外可见吸光度，Iu和Au分别为化合物PMAP荧光积分强度和紫外可见吸光度。

表2 PMAP的乙腈溶液(1.0 μmol·L-1)中加入Fe3+、Cu2+、H+不同组合时的荧光量子产率Table 2 Fluorescence quantum yield of PMAP(1.0 μmol·L-1)upon addition of different combinations of Fe3+,Cu2+,H+in acetonitrile

2.4 分子逻辑门

分子逻辑门是在分子水平上的逻辑操作来描述逻辑门、输入和输出信号，可通过改变离子性质、滴加顺序或者激发波长获得不同的荧光发射波长和荧光强度。由于Fe3+和Cu2+加入后探针PMAP荧光强度减弱以及pH＜4时PMAP荧光强度降低，考察了PMAP中滴加Fe3+、Cu2+和H+不同组合时的荧光强度变化。图8显示，Cu2+、Fe3+、H+以不同组合加入到PMAP中会产生不同的荧光输出信号，PMAP满足三输入NOR逻辑门条件，可构建出NOR分子逻辑门以及分子荧光开关等运算与控制单元。

图8 PMAP溶液中加入Fe3+、Cu2+和H+不同组合时的荧光强度变化Fig.8 Fluorescence intensity of PMAP upon addition of different combinations of Cu2+,Fe3+and H+

依据上述体系荧光性质，以PMAP的乙腈溶液为起始状态，荧光输入信号Input1、Input2和Input3分别为Cu2+、Fe3+和H+，将其设计成一个NOR分子逻辑门，真值表列于表3。结合表2中量子产率，规定逻辑门阀值为0.1，量子产率大于0.1设定为输出信息号1，量子产率小于0.1设定输出信号为0。如表3所示，只有输入信号为(0，0，0)时，体系有强荧光，量子产率大于0.1，体系输出信号为1；其他7种输入信号为(1，0，0)、(0，1，0)、(0，0，1)、(1，0，1)、(0，1，1)、(1，1，0)、(1，1，1)时，体系有弱荧光，量子产率小于0.1，输出信号均为0，说明该体系是一个典型的NOR逻辑系统(图 9)。

图9 PMAP的NOR逻辑门循环示意图Fig.9 Circulation diagram of NOR logic gate for PMAP

表3 PMAP的NOR逻辑门真值表Table 3 Truth table of NOR logic gate for PMAP

2.5 识别机理探讨

根据相关文献[30-32],探针PMAP能较好地选择性识别 Fe3+、Cu2+并形成 1∶1型稳定的配合物,可能是PMAP环上氮原子和氧原子中孤对电子发生跃迁，与Fe3+、Cu2+上d轨道形成d-π型配合物(Scheme 2)。根据Schellhamr的经验，在吡唑啉基的1位、3位和5位引入苯基等助色基团可增加其荧光性；Fe3+、Cu2+的引入也可能受芳环上π电子的作用，增强了主体对客体的包结能力，这对识别Fe3+、Cu2+可能也起了一定的作用。而根据软硬酸碱理论，PMAP环上杂原子作为软给体原子与软金属铜、铁有强的亲和力也是主体识别Fe3+和Cu2+的动力之一。因此，PMAP在环上杂原子的配位作用及芳环上π电子等弱非共价键的协同作用下能够较好地识别Fe3+和Cu2+。

Scheme 2 Proposed recognition mechanism of Fe3+(a)and Cu2+(b)by PMAP

2.6 水样检测

为了进一步探索传感器在实际水样中的应用潜力，采集了南充市嘉陵江水和自来水2种实际水样，并进行了膜预处理以去除悬浮物，然后分别在实际水样中加入不同量的Cu2+和Fe3+，计算其回收率。结果如表4和表5所示，PMAP对Cu2+的重现率为99.4%～103.2%，对Fe3+的重现率为98.3%～102.3%，表明PMAP对实际水样中Cu2+和Fe3+的测定具有较高的准确度和一定的应用前景。

表4 在实际样品中检测Cu2+Table 4 Application in practical samples for detection of Cu2+

表5 在实际样品中检测Fe3+Table 5 Application in practical samples for detection of Fe3+

3 结论

合成了一种新型荧光探针1，5-二苯基-3-(10-(吗啉甲基)蒽-2-基)吡唑啉(PMAP)，利用紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱考察其对金属离子的识别性能。探针PMAP对Fe3+、Cu2+具有良好的识别效果，荧光量子产率分别从0.14降到0.05和0.04，溶液颜色从淡黄色变为蓝色，其中加入Fe3+时红移约45 nm。PMAP与Fe3+/Cu2+以1∶1的化学计量比形成配合物，检测限约为 1 μmol·L-1。通过调控 Fe3+、Cu2+和H+输入信号使PMAP荧光猝灭，在分子水平构建了简单而有效的NOR逻辑电路。另外，在实际样品中的应用表明，PMAP可有效地用于实际水样中Cu2+和Fe3+的检测。因此，荧光传感器PMAP可通过仪器和裸眼在环境监测和工业传感等领域监测和检测Fe3+/Cu2+。

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