基于系统药理学方法研究川楝素对肝癌的抗肿瘤机制

吴其国，胡叶青

（安庆医药高等专科学校 药学系，安徽 安庆246052）

川楝素（C30H38O11，FW=574）是从川楝（Melia Toosendan Sieb Et Zucc）的果实和韧皮部位中分离得到的有效成分之一［1］。川楝素是一种四环三萜类化合物［2-3］，具有驱虫、抗肉毒和抗肿瘤作用［4］，其化学结构如图1 所示。由于川楝素在多种癌症模型中具有新颖的抗癌作用，最近的研究引起了人们越来越多的兴趣［5］。川楝素是胶质母细胞瘤新型抗癌药物的候选者，雌激素受体β 和p53 可以作为癌症对川楝素敏感性的预测生物标志物［6］；川楝素通过抑制AKT/GSK-3β/β-catenin 途径来抑制结直肠癌细胞的生长并诱导其凋亡［7］。

图1 川楝素的化学结构

近年来有很多关于川楝素对肝癌的抗肿瘤研究，但是其机制尚不完全清楚，如川楝素提取物通过抑制小鼠体内肝癌H22 细胞和体外人肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡而具有强大的抗癌作用，细胞凋亡的机制涉及线粒体途径和死亡受体途径［8］；川楝素可上调肝癌细胞死亡受体5（DR5）表达，提高肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体抗肿瘤活性［9］；川楝素能够明显抑制荷瘤小鼠移植瘤的生长,可能与抑制肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡有关［10］。

系统药理学是一种新兴的方法学，从药物和疾病靶标、靶蛋白相互作用和通路等多方面整体上说明药物的作用机制［11］。本研究从整体上通过对多靶点多成分的分析，阐述川楝素作用于肝肿瘤的作用机制。首先应用STITCH、SEA 和TargetNet 等3 种工具预测川楝素的可靠靶点，然后应用DisGeNET 数据库获得肝肿瘤的作用靶点，并利用网络的扩散性原理分别获得药物和疾病的直接和间接作用靶点，把两者的交集基因作为川楝素抗肝癌肿瘤的潜在靶点，利用加权基因关联网络数据库获得潜在靶点中的核心靶点，并将潜在靶点进行GO 功能和KEGG 通路分析，用Cytoscape 软件可视化GO 功能- 靶点- 通路网络图，进一步从整体上阐明作用机制。

1 材料和方法

1.1 川楝素靶点的筛选

通过TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/index.php）获得川楝素的mol2 结构格式，并将其转化成smilie结构格式，分别用SEA 数据库（http://sea.bkslab.org/），STITCH 数据库（http://stitch.embl.de/）和TargetNet 数据库（http://targetnet.scbdd.com/）筛选川楝素的作用靶点。TCMSP 数据库包括化学物质、靶标和药物目标网络以及相关的药物疾病网络［12］。SEA 数据库是利用相似性集成方法，基于蛋白质在其配体之间预设的化学相似性来关联蛋白质，从而预测靶点［13］。STITCH 数据库旨在整合散布在文献中的数据以及各种生物途径、药物- 靶标关系以及结合亲和力的数据库［14］。TargetNet 数据库可用于对任何给定分子，根据当前的化学基因组学数据构建QSAR 模型，可以严格评估和验证与623 种人类蛋白质相关的结果［15］。

1.2 肝肿瘤靶点的筛选

用DisGeNET 数据库（v6.0，https://www.disgenet.org/），以“Liver Neoplasms”为关键词，筛选获得与肝肿瘤相关的靶点。DisGeNET（v6.0）包含628 685 个基因- 疾病关联以及210 498 个变异基因- 疾病关联。其中基因- 疾病关联包括了17 549 个基因与24 166 种疾病、病症、特征和临床或异常人类表型之间；变异基因- 疾病关联包括117 337 变异基因和10 358 种疾病、特征和表型［16］。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建

从HINT 数据库（http://hint.yulab.org/）下载人类全基因互作网络作为背景网络，获取川楝素和肝肿瘤的相互作用的直接和间接靶点，取交集后得到川楝素抗肝癌肿瘤的潜在靶点，再应用STRING 数据库获得潜在靶点的加权基因关联网络信息。HINT 数据库整合了来自8 个相互作用组资源数据库（BioGRID、MINT、iRefWeb、DIP、IntAct、HPRD、MIPS 和PDB）的高质量蛋白相互作用信息［17］。STRING 数据库收集和整合大量生物体的已知和预测的蛋白质- 蛋白质关联数据［18］。

1.4 GO 和KEGG 分析

用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，GO 主要包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）以及分子功能（MF）3 个方面。DAVID 为研究人员提供了一套全面的功能注释工具，以了解大量基因背后的生物学意义［19］。

1.5 GO-靶点-通路网络构建

通过富集分析，获得前10 的GO 功能、KEGG 通路，利用网络可视化软件Cytoscape（3.7.1 版）构建了GO- 靶点- 通路网络，进一步探讨川楝素抗肝肿瘤的系统机制。

2 结果

2.1 筛选出川楝素的靶点

分别用STITCH 数据库、SEA 数据库和TargetNet 数据库（Prob≥0.3）筛选川楝素的可靠靶点，共得到靶点22 个。

2.2 肝肿瘤靶点的筛选

用DisGeNET 数据库，设置score≥0.3，共筛选出与肝肿瘤相关的靶点112 个。

2.3 PPI 网络构建

以HINT 数据库（http://hint.yulab.org/）为人类全基因组蛋白互作信息的背景网络，获取川楝素的间接和直接作用靶点共258 个，肝肿瘤的间接和直接作用靶点共1 342 个，如图2 所示。

图2 川楝素与肝肿瘤的共有靶点（LN 表示肝肿瘤，TSD 表示川楝素）

由图2 可知，取交集共得到川楝素抗肝癌肿瘤的99 个潜在靶点。将潜在靶点导入string 数据库获得潜在靶点的加权蛋白- 蛋白相互作用（PPI）信息，设置minimum required interaction score≥0.900，除去离散的点，用cytoscape 软件可视化PPI 网络，该网络包含了72 个节点，374 条边，如图3 所示。

图3 川楝素抗肝肿瘤的靶点蛋白-蛋白相互作用网络

进一步进行拓扑参数分析，BetweennessCentrality 的中位数是0.00 442 429，degree 的中位数是10，以两个参数的中位数2 倍值筛选出核心靶点9 个分别为：AKT1、EP300、UBC、ESR1、SRC、CREBBP、PIK3R1、CTNNB1、HSP90AA1，如图4 所示。

图4 9 个核心靶点的蛋白-蛋白相互作用

2.4 GO 和KEGG 分析

将PPI 网络中的72 个重要靶点导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），设置P<0.01，共得到225 条GO 功能和66 条KEGG 通路，其中包括BP 131 条，CC 24 条，MF 70 条。分别选择前10 条做富集分析的气泡图，如图5 所示。

图5 GO 和KEGG 富集分析结果

2.5 GO-靶点-通路网络

选取前10 条GO、通路及其靶点，作GO- 靶点- 通路网络，包括72 个靶点，10 条GO，10 条KEGG，共92 个节点，486 条边，如图6 所示。

3 结论与讨论

通过对构建的生物网络的拓扑学参数分析及网络中节点的自由度可知，比较重要的GO 功能有：蛋白质结合（72）、核（56）、核质（44）、胞质溶胶（40）、RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控（30）、RNA 聚合酶II 启动子转录的负调控（23）、转录因子结合（22）和酶结合（22）等；比较重要的通路有：癌症通路（28）、甲状腺激素信号通路（19）、PI3K-Akt 信号通路（19）、前列腺癌通路（17）和癌症中蛋白聚糖通路（16）等；比较重要的靶点有：AKT1（17）、PIK3R1（16）、CTNNB1（14）、GRB2（14）和PIK3R2（14）等。可见川楝素发挥抗肝肿瘤的机制主要与这些生物功能、通路和靶点相关。

图6 GO-靶点-通路网络（椭圆形代表靶点，菱形代表GO，三角形代表通路）

磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）-AKT 信号通路调节许多与细胞存活、增殖及运动有关的细胞过程［20］。在许多类型的癌症中均已报道了PI3K-Akt 的异常激活，并且许多与AKT 相关的信号转导成分的表达和突变的改变也与人类癌症的发生和发展有关［21］。网络药理学的结果同样显示，AKT1 与PIK3R1 在PPI 网络和GO- 靶点- 通路网络中处于重要位置，PI3K-Akt 信号通路在富集分析结果中也处于重要位置。另外，据报道CTNNB1 是肝癌发生中比较普遍的一种突变基因［22］。这些结果表明川楝素抗肿瘤的作用机制可能与预测到的这些靶点和通路密切相关。天然产物衍生的药物通常具有多靶标特性，这正是复杂疾病的治疗药物的特征［23］。本研究表明川楝素可能通过多种靶标和多种信号通路发挥抗肝癌肿瘤效应的治疗作用。

总之，本研究通过系统药理学虚拟筛选的方法阐明了川楝素用于肝癌的抗肿瘤治疗的作用机制。当然由于本研究基于大数据挖掘分析，因此有必要进行进一步的实验研究以验证该发现。值得注意的是，这项工作提供了川楝素抗肝癌肿瘤作用机理的全面而系统的可视化评价。