高通量测序鉴定中间锦鸡儿干旱条件下的microRNA

苏雨萌, 张旭婷, 特日格乐, 田敏, 尚晓蕊, 李国婧, 王瑞刚

(内蒙古农业大学生命科学学院, 植物逆境生理与分子生物学自治区重点实验室, 呼和浩特 010018)

中间锦鸡儿(CaraganaintermediaKuang)是豆科锦鸡儿属荒漠多年生灌木，分布于中国西部、西北和内蒙古的沙质草原和荒漠地区，在固沙、保土、保水等方面发挥着重要作用，具有很高的饲用和生态价值[1]。因其具有较强的抗旱抗盐能力，中间锦鸡儿被认为是阐明对非生物胁迫耐受机制的理想植物。近年来对其分子响应机制的研究日益增多，一些转录因子如NAC[2]、MYB、WRKY[3]和bHLH[4]被鉴定。microRNA(miRNA)是植物体内普遍存在的一类内源性单链20～24 nt非编码RNA，作为mRNA表达的关键调控因子之一，在植物的基因调控、发育过程和应激反应中起着重要作用[5]。干旱作为重要的非生物胁迫之一，目前，针对miRNA响应干旱胁迫研究已经在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycinemax)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、烟草(Nicotianatabacum)等植物中有相关报道[6-7]。miRNAs在植物适应干旱胁迫中起着重要的作用，一些miRNA通过调节酶的代谢和与转录因子相互作用来适应干旱环境[8-10]。因此，对中间锦鸡儿抗旱相关miRNA的鉴定可为进一步阐明抗旱分子机制和锦鸡儿属及豆科植物遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料和干旱处理

选取同一株植物的中间锦鸡儿种子，播种于营养土与蛭石(1:3)中，在光照16 h/黑暗8 h，昼夜温度22～25 ℃的生长室中培养30 d，选取生长状态一致的中间锦鸡儿小苗，从培养钵中取出，尽量避免损伤和刺激，置于原培养环境中进行干燥脱水处理，处理0(对照Drought_0h)、1(Drought_1h)、3(Drought_3h)、12 h(Drought_12h)，每个时间点取6株植物，收集对照及脱水处理样品地上部分(茎和叶)于液氮速冻后存于-80 ℃备用。

1.2 small RNA文库构建和测序

用单步酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法[11]提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性，并用超微量核酸蛋白分析仪定量检测RNA的浓度。对照和干旱胁迫处理1、3、12 h后，从茎叶中得到4份sRNA样品，取3 μg总RNA用 Balancer NGS Library Preparation Kit试剂盒(GnomeGen)构建small RNA cDNA文库，并送武汉ABLife科技有限公司使用Illumina GAIIx进行测序。

1.3 miRNA分类鉴定

首先，剔除低质量测序片段、接头序列以及原始数据中低于16 nt的片段，获得clean reads。然后，利用Rfam数据库通过BLASTn搜索，获得四份样本的长度分布以及共有和特有的序列信息，得到rRNA、tRNA、sRNA、snRNA、lncRNA和miRNA。

读取满足miRNA预测原则的有效长度，然后利用BLASTn与miRBase数据库中已知植物的miRNA进行比对；用miRDeep2软件预测新的miRNA前体能否形成茎环结构，是否具有较低的自由能MFE(minimal free energy)和较高的自由能指数MFEI(minimal free energies index)，筛选新miRNA[16]。通过比较对照和每个干旱处理中miRNA的reads读数进行差异分析，以P值≤0.05，差异倍数(fold change)≥1.5 或≤0.67为标准，筛选差异表达的miRNA。

1.4 miRNA靶基因预测

新预测到的miRNA与中间锦鸡儿干旱胁迫转录组数据通过psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/analysis?function=3.)进行靶基因预测，并通过ATIR(ArabidopsisthalianaL, transcript, removed miRNA gene, ATIR)预测新miRNA在拟南芥中的靶基因，预测规则如下：不允许超过3碱基的错配，互补长度为20 bp以上，中心错配范围在9～11 nt。

2 结果与分析

2.1 中间锦鸡儿miRNA的深度测序与鉴定

为了鉴定干旱胁迫下中间锦鸡儿抗旱相关的miRNA，构建了对照和三种干旱处理的small RNA文库，测序后从4个文库中共获得5.51、7.60、7.91和6.19 M的原始数据，去除低质量测序片段，接头序列和小于16 nt的序列，共有4.95、7.09、7.28 和5.97 M clean data(表1)，比例均在89%～96%之间。利用BLASTn将small RNA序列与Rfam数据库比对，比对到的序列比例占14%～22%，miRNA在四个small RNA文库含量在0.62～0.93 M，大部分有效长度为24 nt，符合miRNA的特点。

表1 中间锦鸡儿small RNA测序及clean reads分类注释结果

2.2 中间锦鸡儿中保守的miRNA

通过比较，共鉴定到88个保守的miRNA，来源于33个miRNA家族(图1)，MIR156家族最大，有12个成员，MIR166、MIR159 和MIR172分别有9、6和5个成员。然而，在MIR158、MIR404、MIR408、MIR832和MIR846家族只有很少的成员，不同的miRNA家族表达差异很大，MIR159 和 MIR396家族有一个非常高的表达，其中cin-miR396a 的表达量在对照组高达535 725 reads。

图1 保守miRNA家族成员数量

2.3 中间锦鸡儿中新的miRNA

除了鉴定中间锦鸡儿中保守的miRNA，遵循植物miRNA的注释标准，鉴定出28个新的miRNA(表2)，他们的前体序列能形成二级发夹结构，MFE值在-58.40～-19.88 kcal·mol-1之间，MFEI值0.68～1.79，新miRNA的表达量较保守miRNA低(图2)，cin-novel-25的表达量最高，在对照组中也仅有1 952 reads。表明中间锦鸡儿中的miRNA大多是保守的，且家族成员分布与其他报道物种一致，保守的较新的miRNA表达量高。

图2 中间锦鸡儿中新miRNA表达量

表2 中间锦鸡中的新miRNA

28个新miRNA的聚类表达谱如图3所示，结果表明，每个miRNA在生物学特性之间具有相似性，干旱处理12 h在一个分支上，与对照相比，1和3 h干旱胁迫处理具有更多的差异表达miRNA，推测干旱处理12 h是中间锦鸡儿干旱响应的极值。干旱处理1和3 h在同一分支上，这两个实验组有较多的相同表达的miRNA。28个新miRNA被分为3组，其中cin-novel-25、cin-novel-3、cin-novel-2和cin-novel-5在前两组，这4个miRNA在对照组和3个干旱处理组中的表达最高，在第三组是表达量相对较低的一些miRNA，cin-novel-26在干旱胁迫处理3 h时表达水平显著高于其他处理，而在对照、干旱胁迫处理1和12 h的表达水平极低。

图3 28个新miRNA在对照和干旱处理中的表达量

2.4 中间锦鸡儿干旱条件下差异表达的miRNA

为了鉴别差异表达的miRNA，以P≤0.05和fold change≥1.5或≤0.67为标准，比较三种干旱处理与对照组miRNA表达水平的差异(表3)。与对照相比，干旱处理3 h差异表达的miRNA最多，包括7个下调表达和10个上调表达的，共17个miRNA；cin-miR164a、cin-miR164b、cin-miR168a、cin-miR168b在干旱胁迫处理中与对照相比下调表达；cin-novel-3、cin-novel-11、cin-novel-21在干旱胁迫处理1和3 h中均上调表达。表明脱水干旱处理3 h差异表达的miRNA较多，cin-novel-26表达量在脱水干旱处理3 h达到极值，推测参与调控较多，可以作为下一步研究的重点。

表3 差异表达的miRNA

2.5 中间锦鸡儿中miRNA靶基因的预测

用psRNATarget预测中间锦鸡儿miRNA的靶基因，28个新miRNA在中间锦鸡儿中共预测到582个靶基因。miRNA与靶基因的作用方式都是一对多的，其中cin-novel-28预测到的靶基因最少，仅有三个；而cin-novel-2预测到了68个靶基因。miRNA与靶基因的作用方式大多数是直接介导靶基因的降解，只有少数是抑制靶基因的翻译，其中cin-novel-27，cin-novel-10和cin-novel-2与靶基因碱基完全互补。28个新miRNA在拟南芥中共预测到212个靶基因，这些靶基因包括SPL蛋白、转录因子、泛素、PPR家族蛋白、生长素应答因子等，且大多数参与干旱胁迫应答；但cin-novel-11、cin-novel-18和 cin-novel-20 在拟南芥中没有预测到靶基因，推测这与miRNA的物种特异性和非保守性有关。

3 讨论

miRNAs在植物对干旱胁迫的适应中起着重要作用。近年来，高通量测序技术被广泛应用于植物miRNAs的鉴定。中间锦鸡儿是一种多年生荒漠灌木，对非生物胁迫有着较为复杂的调控机制。很少有对中间锦鸡儿抗旱相关 miRNAs的调查报道。2017年，Ning等[12]采用高通量测序技术，在干旱胁迫下对柠条中490个保守miRNAs和96个新miRNAs进行了鉴定，在盐胁迫下通过高通量测序在中间锦鸡儿中鉴定出132个保守的miRNAs和10个新的miRNAs。本研究通过solexa高通量测序和生物信息学分析，在中间锦鸡儿中预测了88个保守miRNA和26个新miRNA，其中cin-miR164a、cin-miR164b、cin-miR168a、cin-miR168b在干旱胁迫下表达下调。cin-novel-3、cin-novel-11、cin-novel-21在干旱胁迫处理1和3 h后均较对照组上调，cin-novel-26在3 h干旱胁迫处理中有特异性表达。这些结果表明，脱水干旱处理3 h是有效的干旱处理，为以后的中间锦鸡儿的干旱处理提供了依据。

miRNA的重要研究价值体现在对靶基因表达的调控。在植物中，大多数miRNA和靶基因的作用方式是完全碱基配对的，miRNA参与调控靶基因介导的分裂[13]。由于miRNA靶基因的数量庞大，在线软件被广泛应用于植物miRNA靶基因的预测，psRNATarget是应用最广泛的软件。以鹰嘴豆为例，共鉴定出122个保守的miRNAs和59个新的miRNAs，用psRNATarget预测了358个靶基因[14]。本研究利用psRNATarget数据库预测了28个新的中间锦鸡儿的miRNA，其中中间锦鸡儿靶基因582个，拟南芥靶基因212个。其中cin-miR164a和cin-miR164b是ABA依赖的干旱胁迫NAC转录因子上调的靶基因，与拟南芥和水稻[15]中的相同。但由于物种的特异性，一些miRNA并没有预测到靶基因，这需要深入研究验证。